მეტაბოლომიკა, რომელიც კეთილთვისებიანი და ავთვისებიანი ფილტვის კვანძების მაღალი სპეციფიკურობით გარჩევას ახდენს პაციენტის შრატის მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრიული ანალიზის გამოყენებით.

კომპიუტერული ტომოგრაფიით (CT) გამოვლენილი ფილტვის კვანძების დიფერენციალური დიაგნოზი კლინიკურ პრაქტიკაში კვლავ გამოწვევად რჩება. აქ ჩვენ დავახასიათებთ 480 შრატის ნიმუშის გლობალურ მეტაბოლომს, მათ შორის ჯანმრთელ კონტროლს, კეთილთვისებიან ფილტვის კვანძებს და I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომას. ადენოკარცინომებს ახასიათებთ უნიკალური მეტაბოლომიური პროფილები, მაშინ როდესაც კეთილთვისებიან კვანძებს და ჯანმრთელ პირებს აქვთ მაღალი მსგავსება მეტაბოლომიურ პროფილებში. აღმოჩენის ჯგუფში (n = 306) იდენტიფიცირებული იქნა 27 მეტაბოლიტის ნაკრები კეთილთვისებიანი და ავთვისებიანი კვანძების დიფერენცირებისთვის. დისკრიმინაციული მოდელის AUC შიდა ვალიდაციის (n = 104) და გარე ვალიდაციის (n = 111) ჯგუფებში შესაბამისად 0.915 და 0.945 იყო. გზის ანალიზმა გამოავლინა გლიკოლიზური მეტაბოლიტების მომატება, რომელიც დაკავშირებულია ფილტვის ადენოკარცინომის შრატში ტრიპტოფანის შემცირებასთან კეთილთვისებიან კვანძებთან და ჯანმრთელ კონტროლთან შედარებით და მიუთითა, რომ ტრიპტოფანის შეწოვა ხელს უწყობს გლიკოლიზს ფილტვის კიბოს უჯრედებში. ჩვენი კვლევა ხაზს უსვამს შრატის მეტაბოლიტების ბიომარკერების მნიშვნელობას კომპიუტერული ტომოგრაფიით გამოვლენილი ფილტვის კვანძების რისკის შეფასებაში.
ადრეული დიაგნოზი კრიტიკულად მნიშვნელოვანია კიბოთი დაავადებული პაციენტების გადარჩენის მაჩვენებლების გასაუმჯობესებლად. აშშ-ის ფილტვის კიბოს ეროვნული სკრინინგის კვლევის (NLST) და ევროპული NELSON კვლევის შედეგებმა აჩვენა, რომ დაბალი დოზით კომპიუტერული ტომოგრაფიით (LDCT) სკრინინგს შეუძლია მნიშვნელოვნად შეამციროს ფილტვის კიბოთი გამოწვეული სიკვდილიანობა მაღალი რისკის ჯგუფებში1,2,3. ფილტვის კიბოს სკრინინგისთვის LDCT-ის ფართოდ გამოყენების შემდეგ, უსიმპტომო ფილტვის კვანძების შემთხვევითი რენტგენოგრაფიული აღმოჩენების შემთხვევები კვლავ იზრდება4. ფილტვის კვანძები განისაზღვრება, როგორც 3 სმ-მდე დიამეტრის ფოკალური დაბინდვა5. ჩვენ სირთულეებს ვაწყდებით ავთვისებიანი სიმსივნის ალბათობის შეფასებასა და LDCT-ზე შემთხვევით აღმოჩენილი ფილტვის კვანძების დიდი რაოდენობის მკურნალობაში. კომპიუტერული ტომოგრაფიის შეზღუდვებმა შეიძლება გამოიწვიოს ხშირი შემდგომი გამოკვლევები და ცრუ დადებითი შედეგები, რაც გამოიწვევს არასაჭირო ჩარევას და ზედმეტ მკურნალობას6. ამიტომ, საჭიროა შემუშავდეს სანდო და სასარგებლო ბიომარკერები ფილტვის კიბოს ადრეულ სტადიაზე სწორად იდენტიფიცირებისა და საწყისი გამოვლენის დროს კეთილთვისებიანი კვანძების უმეტესობის დიფერენცირებისთვის7.
სისხლის (შრატი, პლაზმა, პერიფერიული სისხლის მონონუკლეარული უჯრედები) ყოვლისმომცველმა მოლეკულურმა ანალიზმა, მათ შორის გენომიკამ, პროტეომიკამ ან დნმ-ის მეთილირებამ8,9,10, გამოიწვია ფილტვის კიბოს დიაგნოსტიკური ბიომარკერების აღმოჩენისადმი მზარდი ინტერესი. ამასობაში, მეტაბოლომიკის მიდგომები ზომავს უჯრედულ საბოლოო პროდუქტებს, რომლებზეც გავლენას ახდენს ენდოგენური და ეგზოგენური მოქმედებები და შესაბამისად, გამოიყენება დაავადების დაწყებისა და შედეგის პროგნოზირებისთვის. თხევადი ქრომატოგრაფია-ტანდემური მას-სპექტრომეტრია (LC-MS) მეტაბოლომიკის კვლევებისთვის ფართოდ გამოყენებული მეთოდია მისი მაღალი მგრძნობელობისა და დიდი დინამიური დიაპაზონის გამო, რომელსაც შეუძლია მოიცვას სხვადასხვა ფიზიკურ-ქიმიური თვისებების მქონე მეტაბოლიტები11,12,13. მიუხედავად იმისა, რომ პლაზმის/შრატის გლობალური მეტაბოლომიური ანალიზი გამოყენებულია ფილტვის კიბოს დიაგნოზთან14,15,16,17 და მკურნალობის ეფექტურობასთან დაკავშირებული ბიომარკერების იდენტიფიცირებისთვის18, შრატის მეტაბოლიტების კლასიფიკატორები კეთილთვისებიანი და ავთვისებიანი ფილტვის კვანძების განსასხვავებლად ჯერ კიდევ შესასწავლია. -მასიური კვლევა.
ადენოკარცინომა და ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა არაწვრილუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს (NSCLC) ორი ძირითადი ქვეტიპია. სხვადასხვა კომპიუტერული ტომოგრაფიული სკრინინგის ტესტები მიუთითებს, რომ ადენოკარცინომა ფილტვის კიბოს ყველაზე გავრცელებული ჰისტოლოგიური ტიპია1,19,20,21. ამ კვლევაში, ჩვენ გამოვიყენეთ ულტრაეფექტური თხევადი ქრომატოგრაფიით-მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრია (UPLC-HRMS) მეტაბოლომიკური ანალიზის ჩასატარებლად სულ 695 შრატის ნიმუშზე, მათ შორის ჯანმრთელ კონტროლზე, კეთილთვისებიან ფილტვის კვანძებზე და კომპიუტერული ტომოგრაფიით აღმოჩენილ ≤3 სმ-ზე. I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომის სკრინინგი. ჩვენ გამოვავლინეთ შრატის მეტაბოლიტების პანელი, რომელიც განასხვავებს ფილტვის ადენოკარცინომას კეთილთვისებიანი კვანძებისა და ჯანმრთელი კონტროლისგან. გზის გამდიდრების ანალიზმა აჩვენა, რომ ტრიპტოფანისა და გლუკოზის მეტაბოლიზმის პათოლოგიები ფილტვის ადენოკარცინომაში გავრცელებული ცვლილებებია კეთილთვისებიან კვანძებთან და ჯანმრთელ კონტროლთან შედარებით. და ბოლოს, ჩვენ შევქმენით და დავადასტურეთ შრატის მეტაბოლური კლასიფიკატორი მაღალი სპეციფიკურობითა და მგრძნობელობით, რათა განვასხვავოთ LDCT-ით აღმოჩენილი ავთვისებიანი და კეთილთვისებიანი ფილტვის კვანძები, რამაც შეიძლება ხელი შეუწყოს ადრეულ დიფერენციალურ დიაგნოზს და რისკის შეფასებას.
მიმდინარე კვლევაში, სქესისა და ასაკის შესაბამისი შრატის ნიმუშები რეტროსპექტულად შეგროვდა 174 ჯანმრთელი საკონტროლო ჯგუფისგან, 292 პაციენტისგან კეთილთვისებიანი ფილტვის კვანძებით და 229 პაციენტისგან I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომით. 695 სუბიექტის დემოგრაფიული მახასიათებლები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში 1.
როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 1ა-ში, სუნ იატ-სენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრში შეგროვდა სულ 480 შრატის ნიმუში, მათ შორის 174 ჯანმრთელი საკონტროლო (HC), 170 კეთილთვისებიანი კვანძი (BN) და 136 I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომის (LA) ნიმუში. ულტრაეფექტური თხევადი ქრომატოგრაფიის მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრიის (UPLC-HRMS) გამოყენებით არამიზნობრივი მეტაბოლომიური პროფილირების აღმოჩენის კოჰორტა. როგორც ნაჩვენებია დამატებით ნახაზ 1-ში, კლასიფიკაციის მოდელის შესაქმნელად და დიფერენციალური გზის ანალიზის შემდგომი შესწავლის მიზნით, იდენტიფიცირებული იქნა LA-სა და HC-ს, LA-სა და BN-ს შორის დიფერენციალური მეტაბოლიტები. სუნ იატ-სენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრის მიერ შეგროვებული 104 ნიმუში და ორი სხვა საავადმყოფოს მიერ შეგროვებული 111 ნიმუში, შესაბამისად, შიდა და გარე ვალიდაციას დაექვემდებარა.
ა) კვლევის პოპულაცია აღმოჩენის კოჰორტაში, რომელმაც გაიარა გლობალური შრატის მეტაბოლომიკის ანალიზი ულტრაეფექტური თხევადი ქრომატოგრაფიით-მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრიის (UPLC-HRMS) გამოყენებით. ბ) კვლევის კოჰორტიდან აღებული 480 შრატის ნიმუშის მთლიანი მეტაბოლომის ნაწილობრივი უმცირესი კვადრატების დისკრიმინანტული ანალიზი (PLS-DA), მათ შორის ჯანმრთელი კონტროლი (HC, n = 174), კეთილთვისებიანი კვანძები (BN, n = 170) და I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომა (ლოს-ანჯელესი, n = 136). +ESI, დადებითი ელექტროსპრეის იონიზაციის რეჟიმი, -ESI, უარყოფითი ელექტროსპრეის იონიზაციის რეჟიმი. გ–ე მეტაბოლიტები მნიშვნელოვნად განსხვავებული სიმრავლით ორ მოცემულ ჯგუფში (ორმხრივი ვილკოქსონის ნიშნის რანგული ტესტი, ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებლის კორექტირებული p მნიშვნელობა, FDR <0.05) ნაჩვენებია წითლად (ნაკეცის ცვლილება > 1.2) და ლურჯად (ნაკეცის ცვლილება < 0.83). ვ) ნაჩვენებია ვულკანის გრაფიკზე. ვ) იერარქიული კლასტერიზაციის სითბური რუკა, რომელიც აჩვენებს მნიშვნელოვან განსხვავებებს ანოტირებული მეტაბოლიტების რაოდენობაში LA-სა და BN-ს შორის. წყაროს მონაცემები მოწოდებულია წყაროს მონაცემთა ფაილების სახით.
აღმოჩენის ჯგუფში 174 HC, 170 BN და 136 LA-ს შრატის მთლიანი მეტაბოლომი გაანალიზდა UPLC-HRMS ანალიზის გამოყენებით. ჩვენ თავდაპირველად ვაჩვენებთ, რომ ხარისხის კონტროლის (QC) ნიმუშები მჭიდროდ არის დაჯგუფებული ზედამხედველობის გარეშე მთავარი კომპონენტის ანალიზის (PCA) მოდელის ცენტრში, რაც ადასტურებს მიმდინარე კვლევის სტაბილურობას (დამატებითი სურათი 2).
როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 1b-ზე მოცემულ უმცირესი კვადრატების ნაწილობრივი დისკრიმინანტული ანალიზით (PLS-DA), აღმოვაჩინეთ, რომ LA-სა და BN-ს, LA-სა და HC-ს შორის აშკარა განსხვავებები იყო დადებით (+ESI) და უარყოფით (-ESI) ელექტროსპრეის იონიზაციის რეჟიმებში. თუმცა, +ESI და -ESI პირობებში BN-სა და HC-ს შორის მნიშვნელოვანი განსხვავებები არ აღმოჩნდა.
ჩვენ აღმოვაჩინეთ 382 დიფერენციალური მახასიათებელი LA-სა და HC-ს შორის, 231 დიფერენციალური მახასიათებელი LA-სა და BN-ს შორის და 95 დიფერენციალური მახასიათებელი BN-სა და HC-ს შორის (ვილკოქსონის ნიშან-თვისებითი რანგის ტესტი, FDR <0.05 და მრავლობითი ცვლილება >1.2 ან <0.83) (სურათი .1c-e). . პიკები დამატებით ანოტირებული იქნა (დამატებითი მონაცემები 3) მონაცემთა ბაზის (mzCloud/HMDB/Chemspider ბიბლიოთეკა) მიმართებით m/z მნიშვნელობის, შეკავების დროის და ფრაგმენტაციის მას-სპექტრის ძიების მიხედვით (დეტალები აღწერილია მეთოდების განყოფილებაში)22. დაბოლოს, LA-სა და BN-ს შორის (სურათი 1f და დამატებითი ცხრილი 2) და LA-სა და HC-ს შორის (დამატებითი სურათი 3 და დამატებითი ცხრილი 2) შესაბამისად, გამოვლინდა 33 და 38 ანოტირებული მეტაბოლიტი სიმრავლის მნიშვნელოვანი განსხვავებებით. ამის საპირისპიროდ, BN-სა და HC-ში (დამატებითი ცხრილი 2) გამოვლინდა მხოლოდ 3 მეტაბოლიტი სიმრავლის მნიშვნელოვანი განსხვავებებით, რაც შეესაბამება PLS-DA-ში BN-სა და HC-ს შორის გადაფარვას. ეს დიფერენციალური მეტაბოლიტები მოიცავს ბიოქიმიური ნივთიერებების ფართო სპექტრს (დამატებითი სურათი 4). ერთად აღებული, ეს შედეგები აჩვენებს შრატის მეტაბოლომში მნიშვნელოვან ცვლილებებს, რაც ასახავს ფილტვის კიბოს ადრეული სტადიის ავთვისებიან ტრანსფორმაციას კეთილთვისებიან ფილტვის კვანძებთან ან ჯანმრთელ სუბიექტებთან შედარებით. ამასობაში, BN-ის და HC-ის შრატის მეტაბოლომების მსგავსება მიუთითებს, რომ კეთილთვისებიან ფილტვის კვანძებს შეიძლება ჰქონდეთ მრავალი ბიოლოგიური მახასიათებელი ჯანმრთელ ინდივიდებთან. იმის გათვალისწინებით, რომ ეპიდერმული ზრდის ფაქტორის რეცეპტორის (EGFR) გენის მუტაციები ხშირია ფილტვის ადენოკარცინომის ქვეტიპ 23-ში, ჩვენ შევეცადეთ გაგვერკვია მამოძრავებელი მუტაციების გავლენა შრატის მეტაბოლომზე. შემდეგ გავაანალიზეთ ფილტვის ადენოკარცინომის ჯგუფში EGFR სტატუსის მქონე 72 შემთხვევის საერთო მეტაბოლომიური პროფილი. საინტერესოა, რომ PCA ანალიზში აღმოვაჩინეთ შედარებითი პროფილები EGFR მუტანტის მქონე პაციენტებს (n = 41) და EGFR ველური ტიპის პაციენტებს (n = 31) შორის (დამატებითი სურათი 5ა). თუმცა, ჩვენ გამოვავლინეთ 7 მეტაბოლიტი, რომელთა რაოდენობა მნიშვნელოვნად შეიცვალა EGFR მუტაციის მქონე პაციენტებში ველური ტიპის EGFR-ის მქონე პაციენტებთან შედარებით (t ტესტი, p < 0.05 და ცვლილება > 1.2 ან < 0.83) (დამატებითი სურათი 5ბ). ამ მეტაბოლიტების უმეტესობა (7-დან 5) არის აცილკარნიტინები, რომლებიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ცხიმოვანი მჟავების დაჟანგვის გზებში.
როგორც ილუსტრირებულია ნახაზ 2ა-ზე ნაჩვენებ სამუშაო პროცესში, კვანძების კლასიფიკაციის ბიომარკერები მიღებული იქნა LA-ში (n = 136) და BN-ში (n = 170) იდენტიფიცირებული 33 დიფერენციალური მეტაბოლიტის საფუძველზე გამოვლენილი უმცირესი აბსოლუტური შეკუმშვის ოპერატორებისა და შერჩევის გამოყენებით. ცვლადების საუკეთესო კომბინაცია (LASSO) – ბინარული ლოგისტიკური რეგრესიის მოდელი. მოდელის სანდოობის შესამოწმებლად გამოყენებული იქნა ათჯერადი ჯვარედინი ვალიდაცია. ცვლადების შერჩევა და პარამეტრების რეგულარიზაცია რეგულირდება ალბათობის მაქსიმიზაციის ჯარიმით პარამეტრით λ24. გლობალური მეტაბოლომიკის ანალიზი შემდგომ დამოუკიდებლად ჩატარდა შიდა ვალიდაციის (n = 104) და გარე ვალიდაციის (n = 111) ჯგუფებში, რათა შემოწმებულიყო დისკრიმინანტული მოდელის კლასიფიკაციის შესრულება. შედეგად, აღმოჩენის ნაკრებში 27 მეტაბოლიტი იდენტიფიცირებული იქნა, როგორც საუკეთესო დისკრიმინანტული მოდელი ყველაზე დიდი საშუალო AUC მნიშვნელობით (ნახ. 2ბ), რომელთაგან 9-ს ჰქონდა გაზრდილი აქტივობა და 18-ს შემცირებული აქტივობა LA-ში BN-თან შედარებით (ნახ. 2გ).
ფილტვის კვანძების კლასიფიკატორის შექმნის სამუშაო პროცესი, მათ შორის, აღმოჩენის ნაკრებში შრატის მეტაბოლიტების საუკეთესო პანელის შერჩევა ორობითი ლოგისტიკური რეგრესიის მოდელის გამოყენებით ათჯერადი ჯვარედინი ვალიდაციის გზით და პროგნოზირების შესრულების შეფასება შიდა და გარე ვალიდაციის ნაკრებებში. ბ მეტაბოლური ბიომარკერების შერჩევის LASSO რეგრესიული მოდელის ჯვარედინი ვალიდაციის სტატისტიკა. ზემოთ მოცემული რიცხვები წარმოადგენს მოცემულ λ-ზე შერჩეული ბიომარკერების საშუალო რაოდენობას. წითელი წერტილოვანი ხაზი წარმოადგენს საშუალო AUC მნიშვნელობას შესაბამის ლამბდაზე. ნაცრისფერი შეცდომის ზოლები წარმოადგენს მინიმალურ და მაქსიმალურ AUC მნიშვნელობებს. წერტილოვანი ხაზი მიუთითებს საუკეთესო მოდელს 27 შერჩეული ბიომარკერით. AUC, მიმღების ოპერაციული მახასიათებლის (ROC) მრუდის ქვეშ არსებული ფართობი. გ LA ჯგუფში 27 შერჩეული მეტაბოლიტის ნაკადური ცვლილებები აღმოჩენის ჯგუფში BN ჯგუფთან შედარებით. წითელი სვეტი - აქტივაცია. ლურჯი სვეტი არის კლება. d–f მიმღების ოპერაციული მახასიათებლის (ROC) მრუდები, რომლებიც აჩვენებს დისკრიმინანტული მოდელის სიმძლავრეს აღმოჩენის, შიდა და გარე ვალიდაციის ნაკრებებში 27 მეტაბოლიტის კომბინაციის საფუძველზე. წყაროს მონაცემები მოწოდებულია წყაროს მონაცემთა ფაილების სახით.
პროგნოზირების მოდელი შეიქმნა ამ 27 მეტაბოლიტის შეწონილი რეგრესიის კოეფიციენტების საფუძველზე (დამატებითი ცხრილი 3). ამ 27 მეტაბოლიტის საფუძველზე ჩატარებულმა ROC ანალიზმა აჩვენა მრუდის ქვეშ ფართობის (AUC) მნიშვნელობა 0.933, აღმოჩენის ჯგუფის მგრძნობელობა იყო 0.868, ხოლო სპეციფიკურობა 0.859 (სურ. 2დ). ამასობაში, LA-სა და HC-ს შორის ანოტირებულ 38 დიფერენციალურ მეტაბოლიტს შორის, 16 მეტაბოლიტის ნაკრებმა მიაღწია AUC 0.902-ს, მგრძნობელობით 0.801 და სპეციფიკურობით 0.856 LA-სა და HC-ს შორის გარჩევისას (დამატებითი სურათი 6ა-გ). ასევე შედარებული იქნა დიფერენციალური მეტაბოლიტების სხვადასხვა ზღურბლზე დაფუძნებული AUC მნიშვნელობები. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ კლასიფიკაციის მოდელი საუკეთესოდ მუშაობდა LA-სა და BN (HC)-ს შორის გარჩევისას, როდესაც ნაკეცის ცვლილების დონე დაყენებული იყო 1.2-ზე 1.5-ის ან 2.0-ის წინააღმდეგ (დამატებითი სურათი 7ა,ბ). 27 მეტაბოლიტის ჯგუფზე დაფუძნებული კლასიფიკაციის მოდელი დამატებით დადასტურდა შიდა და გარე კოჰორტებში. შიდა ვალიდაციისთვის AUC იყო 0.915 (მგრძნობელობა 0.867, სპეციფიკურობა 0.811) და გარე ვალიდაციისთვის 0.945 (მგრძნობელობა 0.810, სპეციფიკურობა 0.979) (სურ. 2ე, ვ). ლაბორატორიათშორისი ეფექტურობის შესაფასებლად, გარე კოჰორტიდან აღებული 40 ნიმუში გაანალიზდა გარე ლაბორატორიაში, როგორც ეს აღწერილია მეთოდების განყოფილებაში. კლასიფიკაციის სიზუსტით მიღწეული იქნა AUC 0.925 (დამატებითი სურათი 8). რადგან ფილტვის ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC) არაწვრილუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს (NSCLC) მეორე ყველაზე გავრცელებული ქვეტიპია ფილტვის ადენოკარცინომის (LUAD) შემდეგ, ჩვენ ასევე გამოვცადეთ მეტაბოლური პროფილების დადასტურებული პოტენციური სარგებლიანობა. BN და LUSC-ის 16 შემთხვევა. LUSC-სა და BN-ს შორის განსხვავების AUC იყო 0.776 (დამატებითი სურათი 9), რაც მიუთითებს LUAD-სა და BN-ს შორის განსხვავების უფრო დაბალ უნარზე.
კვლევებმა აჩვენა, რომ კომპიუტერული ტომოგრაფიის სურათებზე კვანძების ზომა დადებითად კორელაციაშია ავთვისებიანი სიმსივნის ალბათობასთან და კვანძების მკურნალობის მთავარ განმსაზღვრელ ფაქტორად რჩება25,26,27. NELSON-ის სკრინინგის კვლევის დიდი კოჰორტის მონაცემების ანალიზმა აჩვენა, რომ 5 მმ-ზე ნაკლები კვანძების მქონე სუბიექტებში ავთვისებიანი სიმსივნის რისკი მსგავსი იყო კვანძების არმქონე სუბიექტების28. ამიტომ, რეგულარული კომპიუტერული ტომოგრაფიული მონიტორინგის საჭირო მინიმალური ზომაა 5 მმ, როგორც ეს რეკომენდებულია ბრიტანეთის თორაკალური საზოგადოების (BTS) მიერ, და 6 მმ, როგორც ეს რეკომენდებულია ფლეიშნერის საზოგადოების მიერ29. თუმცა, 6 მმ-ზე დიდი ზომის და აშკარა კეთილთვისებიანი ნიშნების გარეშე კვანძები, რომლებსაც განუსაზღვრელი ფილტვის კვანძები (IPN) ეწოდება, კლინიკურ პრაქტიკაში შეფასებისა და მართვის მთავარ გამოწვევად რჩება30,31. შემდეგ ჩვენ შევისწავლეთ, მოქმედებდა თუ არა კვანძის ზომა მეტაბოლომიურ ხელმოწერებზე, აღმოჩენისა და შიდა ვალიდაციის კოჰორტებიდან აღებული გაერთიანებული ნიმუშების გამოყენებით. 27 ვალიდირებულ ბიომარკერზე ფოკუსირებით, ჩვენ ჯერ შევადარეთ HC და BN 6 მმ-ზე ნაკლები მეტაბოლომების PCA პროფილები. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ HC-სა და BN-ის მონაცემთა წერტილების უმეტესობა ემთხვეოდა ერთმანეთს, რაც აჩვენებს, რომ შრატის მეტაბოლიტების დონეები ორივე ჯგუფში მსგავსი იყო (სურ. 3ა). სხვადასხვა ზომის დიაპაზონის მახასიათებლების რუკები შენარჩუნებული დარჩა BN-სა და LA-ში (სურ. 3ბ, გ), მაშინ როდესაც ავთვისებიან და კეთილთვისებიან კვანძებს შორის განსხვავება დაფიქსირდა 6-20 მმ დიაპაზონში (სურ. 3დ). ამ კოჰორტას ჰქონდა AUC 0.927, სპეციფიკურობა 0.868 და მგრძნობელობა 0.820 6-დან 20 მმ-მდე ზომის კვანძების ავთვისებიანობის პროგნოზირებისთვის (სურ. 3ე, ვ). ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ კლასიფიკატორს შეუძლია დააფიქსიროს ადრეული ავთვისებიანი ტრანსფორმაციით გამოწვეული მეტაბოლური ცვლილებები, კვანძის ზომის მიუხედავად.
ად PCA პროფილების შედარება მითითებულ ჯგუფებს შორის 27 მეტაბოლიტის მეტაბოლური კლასიფიკატორის საფუძველზე. CC და BN < 6 მმ. ბ BN < 6 მმ BN 6–20 მმ-ის წინააღმდეგ. LA 6–20 მმ-ში LA 20–30 მმ-ის წინააღმდეგ. გ BN 6–20 მმ და LA 6–20 მმ. GC, n = 174; BN < 6 მმ, n = 153; BN 6–20 მმ, n = 91; LA 6–20 მმ, n = 89; LA 20–30 მმ, n = 77. ე მიმღების ოპერაციული მახასიათებლების (ROC) მრუდი, რომელიც აჩვენებს დისკრიმინანტული მოდელის მუშაობას 6–20 მმ კვანძებისთვის. ვ ალბათური მნიშვნელობები გამოითვალა ლოგისტიკური რეგრესიის მოდელის საფუძველზე 6–20 მმ ზომის კვანძებისთვის. ნაცრისფერი წერტილოვანი ხაზი წარმოადგენს ოპტიმალურ ზღვრულ მნიშვნელობას (0.455). ზემოთ მოცემული რიცხვები წარმოადგენს ლოს-ანჯელესისთვის პროგნოზირებული შემთხვევების პროცენტულ მაჩვენებელს. გამოიყენეთ ორმხრივი სტუდენტის t ტესტი. PCA, მთავარი კომპონენტების ანალიზი. AUC-ის ფართობი მრუდის ქვეშ. წყაროს მონაცემები მოწოდებულია წყაროს მონაცემთა ფაილების სახით.
შემოთავაზებული ავთვისებიანი სიმსივნის პროგნოზირების მოდელის ეფექტურობის საილუსტრაციოდ შეირჩა ოთხი ნიმუში (44–61 წლის), მსგავსი ზომის ფილტვის კვანძებით (7–9 მმ) (სურ. 4ა, ბ). საწყისი სკრინინგის დროს, შემთხვევა 1 წარმოდგენილი იყო როგორც მყარი კვანძი კალციფიკაციით, რაც კეთილთვისებიანობასთან ასოცირდება, ხოლო შემთხვევა 2 წარმოდგენილი იყო როგორც გაურკვეველი ნაწილობრივ მყარი კვანძი აშკარა კეთილთვისებიანი ნიშნების გარეშე. შემდგომი კომპიუტერული ტომოგრაფიის სამმა რაუნდმა აჩვენა, რომ ეს შემთხვევები სტაბილური დარჩა 4 წლის განმავლობაში და შესაბამისად, კეთილთვისებიან კვანძებად ითვლებოდა (სურ. 4ა). სერიული კომპიუტერული ტომოგრაფიის კლინიკურ შეფასებასთან შედარებით, მიმდინარე კლასიფიკატორის მოდელის გამოყენებით ერთჯერადი შრატის მეტაბოლიტების ანალიზმა სწრაფად და სწორად გამოავლინა ეს კეთილთვისებიანი კვანძები ალბათური შეზღუდვების საფუძველზე (ცხრილი 1). შემთხვევა 3-ში სურათი 4ბ გვიჩვენებს კვანძს პლევრის რეტრაქციის ნიშნებით, რომელიც ყველაზე ხშირად ასოცირდება ავთვისებიანობასთან32. შემთხვევა 4 წარმოდგენილი იყო როგორც გაურკვეველი ნაწილობრივ მყარი კვანძი კეთილთვისებიანი მიზეზის მტკიცებულების გარეშე. კლასიფიკატორის მოდელის მიხედვით, ყველა ეს შემთხვევა ავთვისებიანად იქნა პროგნოზირებული (ცხრილი 1). ფილტვის ადენოკარცინომის შეფასება დადასტურდა ფილტვის რეზექციის ოპერაციის შემდეგ ჰისტოპათოლოგიური გამოკვლევით (სურ. 4ბ). გარე ვალიდაციის ნაკრებისთვის, მეტაბოლურმა კლასიფიკატორმა ზუსტად იწინასწარმეტყველა 6 მმ-ზე მეტი ზომის გაურკვეველი ფილტვის კვანძების ორი შემთხვევა (დამატებითი სურათი 10).
ფილტვების კეთილთვისებიანი კვანძების ორი შემთხვევის ღერძული ფანჯრის კომპიუტერული ტომოგრაფიული გამოსახულებები. პირველ შემთხვევაში, 4 წლის შემდეგ კომპიუტერული ტომოგრაფიით გამოვლინდა სტაბილური მყარი კვანძი, რომლის ზომა იყო 7 მმ, მარჯვენა ქვედა წილში კალციფიკაციით. მეორე შემთხვევაში, 5 წლის შემდეგ კომპიუტერული ტომოგრაფიით გამოვლინდა სტაბილური, ნაწილობრივ მყარი კვანძი, რომლის დიამეტრი იყო 7 მმ მარჯვენა ზედა წილში. ბ) ფილტვების ღერძული ფანჯრის კომპიუტერული ტომოგრაფიული გამოსახულებები და შესაბამისი პათოლოგიური კვლევები I სტადიის ადენოკარცინომის ორი შემთხვევისთვის ფილტვის რეზექციამდე. მესამე შემთხვევაში, მარჯვენა ზედა წილში გამოვლინდა 8 მმ დიამეტრის კვანძი პლევრის შეკუმშვით. მეოთხე შემთხვევაში, მარცხენა ზედა წილში გამოვლინდა ნაწილობრივ მყარი მქრქალი მინის კვანძი, რომლის ზომა იყო 9 მმ. რეზექცირებული ფილტვის ქსოვილის ჰემატოქსილინითა და ეოზინით (H&E) შეღებვა (მასშტაბის ზოლი = 50 μm), რომელიც აჩვენებს ფილტვის ადენოკარცინომის აცინარული ზრდის ნიმუშს. ისრები მიუთითებს კომპიუტერული ტომოგრაფიით გამოვლენილ კვანძებზე. H&E გამოსახულებები წარმოადგენს პათოლოგის მიერ გამოკვლეული მრავალი (>3) მიკროსკოპული ველის წარმომადგენლობით გამოსახულებებს.
ჩვენი შედეგები ერთად აღებული აჩვენებს შრატის მეტაბოლიტების ბიომარკერების პოტენციურ ღირებულებას ფილტვის კვანძების დიფერენციალურ დიაგნოზში, რამაც შეიძლება სირთულეები შექმნას კომპიუტერული ტომოგრაფიის სკრინინგის შეფასებისას.
ვალიდირებული დიფერენციალური მეტაბოლიტების პანელის საფუძველზე, ჩვენ ვცდილობდით დაგვედგენინა ძირითადი მეტაბოლური ცვლილებების ბიოლოგიური კორელატები. MetaboAnalyst-ის მიერ ჩატარებულმა KEGG გზის გამდიდრების ანალიზმა გამოავლინა 6 საერთო მნიშვნელოვნად შეცვლილი გზა ორ მოცემულ ჯგუფს შორის (LA vs. HC და LA vs. BN, კორექტირებული p ≤ 0.001, ეფექტი > 0.01). ეს ცვლილებები ხასიათდებოდა პირუვატის მეტაბოლიზმის, ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმის, ნიაცინისა და ნიკოტინამიდის მეტაბოლიზმის, გლიკოლიზის, TCA ციკლის და პურინის მეტაბოლიზმის დარღვევებით (სურ. 5ა). შემდეგ ჩვენ ჩავატარეთ მიზნობრივი მეტაბოლომიკა ძირითადი ცვლილებების გადასამოწმებლად აბსოლუტური რაოდენობრივი შეფასების გამოყენებით. საერთო მეტაბოლიტების განსაზღვრა ხშირად შეცვლილ გზებში სამმაგი კვადრუპოლური მას-სპექტრომეტრიით (QQQ) ავთენტური მეტაბოლიტების სტანდარტების გამოყენებით. მეტაბოლომიკის კვლევის სამიზნე ნიმუშის დემოგრაფიული მახასიათებლები მოცემულია დამატებით ცხრილში 4. ჩვენი გლობალური მეტაბოლომიკის შედეგებთან შესაბამისობაში, რაოდენობრივმა ანალიზმა დაადასტურა, რომ ჰიპოქსანტინის, ქსანტინის, პირუვატის და ლაქტატის დონეები LA-ში გაზრდილი იყო BN-თან და HC-თან შედარებით (სურ. 5ბ, გ, p <0.05). თუმცა, BN-სა და HC-ს შორის ამ მეტაბოლიტების მნიშვნელოვანი განსხვავებები არ დაფიქსირებულა.
LA ჯგუფში მნიშვნელოვნად განსხვავებული მეტაბოლიტების KEGG გზის გამდიდრების ანალიზი BN და HC ჯგუფებთან შედარებით. გამოყენებული იქნა ორმხრივი Globaltest და p მნიშვნელობები შესწორებული იქნა Holm-Bonferroni მეთოდის გამოყენებით (კორექტირებული p ≤ 0.001 და ეფექტის ზომა > 0.01). b–d ვიოლინოს დიაგრამები, რომლებიც აჩვენებს ჰიპოქსანტინის, ქსანტინის, ლაქტატის, პირუვატის და ტრიპტოფანის დონეებს შრატის HC, BN და LA-ში, განსაზღვრული LC-MS/MS-ით (n = 70 ჯგუფში). თეთრი და შავი წერტილოვანი ხაზები მიუთითებს შესაბამისად მედიანას და კვარტილს. e ვიოლინოს დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს SLC7A5-ის და QPRT-ის ნორმალიზებულ Log2TPM (ტრანსკრიპტები მილიონზე) mRNA ექსპრესიას ფილტვის ადენოკარცინომაში (n = 513) ნორმალურ ფილტვის ქსოვილთან შედარებით (n = 59) LUAD-TCGA მონაცემთა ნაკრებში. თეთრი ჩარჩო წარმოადგენს კვარტილთაშორის დიაპაზონს, ცენტრში ჰორიზონტალური შავი ხაზი წარმოადგენს მედიანას, ხოლო ჩარჩოდან გამომავალი ვერტიკალური შავი ხაზი წარმოადგენს 95%-იან სანდოობის ინტერვალს (CI). f SLC7A5 და GAPDH ექსპრესიის პირსონის კორელაციის დიაგრამა ფილტვის ადენოკარცინომაში (n = 513) და ნორმალურ ფილტვის ქსოვილში (n = 59) TCGA მონაცემთა ნაკრებში. ნაცრისფერი არე წარმოადგენს 95%-იან CI-ს. r, პირსონის კორელაციის კოეფიციენტი. g ნორმალიზებული უჯრედული ტრიპტოფანის დონეები A549 უჯრედებში, რომლებიც ტრანსფექცირებულია არასპეციფიკური shRNA კონტროლით (NC) და shSLC7A5 (Sh1, Sh2), განისაზღვრა LC-MS/MS მეთოდით. ​​წარმოდგენილია თითოეულ ჯგუფში ხუთი ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუშის სტატისტიკური ანალიზი. h NADt-ის (საერთო NAD, მათ შორის NAD+ და NADH) უჯრედული დონეები A549 უჯრედებში (NC) და SLC7A5 ნოკდაუნირებულ A549 უჯრედებში (Sh1, Sh2). წარმოდგენილია თითოეულ ჯგუფში სამი ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუშის სტატისტიკური ანალიზი. i A549 უჯრედების გლიკოლიზური აქტივობა SLC7A5 ნოკდაუნამდე და მის შემდეგ გაიზომა უჯრედგარე მჟავიანობის სიჩქარით (ECAR) (n = 4 ბიოლოგიურად დამოუკიდებელი ნიმუში თითო ჯგუფში). 2-DG,2-დეოქსი-D-გლუკოზა. (b–h)-ში გამოყენებული იყო ორმხრივი სტუდენტის t ტესტი. (g–i)-ში შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტული გადახრას, თითოეული ექსპერიმენტი ჩატარდა სამჯერ დამოუკიდებლად და შედეგები მსგავსი იყო. წყაროს მონაცემები მოცემულია წყაროს მონაცემთა ფაილების სახით.
LA ჯგუფში ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმის ცვლილების მნიშვნელოვანი გავლენის გათვალისწინებით, ჩვენ ასევე შევაფასეთ შრატის ტრიპტოფანის დონე HC, BN და LA ჯგუფებში QQQ-ის გამოყენებით. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ შრატის ტრიპტოფანი შემცირებული იყო LA-ში HC-სთან ან BN-თან შედარებით (p < 0.001, სურათი 5d), რაც შეესაბამება წინა დასკვნებს, რომ ფილტვის კიბოთი დაავადებულ პაციენტებში მოცირკულირე ტრიპტოფანის დონე უფრო დაბალია, ვიდრე საკონტროლო ჯგუფის ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფში33,34,35. კიდევ ერთმა კვლევამ, რომელიც იყენებდა PET/CT მარკერის 11C-მეთილ-L-ტრიპტოფანს, აჩვენა, რომ ტრიპტოფანის სიგნალის შეკავების დრო ფილტვის კიბოს ქსოვილში მნიშვნელოვნად გაიზარდა კეთილთვისებიან დაზიანებებთან ან ნორმალურ ქსოვილთან შედარებით36. ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ LA შრატში ტრიპტოფანის შემცირება შეიძლება ასახავდეს ფილტვის კიბოს უჯრედების მიერ ტრიპტოფანის აქტიურ შეწოვას.
ასევე ცნობილია, რომ ტრიპტოფანის კატაბოლიზმის კინურენინის გზის საბოლოო პროდუქტია NAD+37,38, რომელიც წარმოადგენს მნიშვნელოვან სუბსტრატს გლიცერალდეჰიდ-3-ფოსფატისა და 1,3-ბისფოსფოგლიცერატის რეაქციისთვის გლიკოლიზში39. მიუხედავად იმისა, რომ წინა კვლევები ფოკუსირებული იყო ტრიპტოფანის კატაბოლიზმის როლზე იმუნურ რეგულაციაში, ჩვენ ვცდილობდით გაგვერკვია ტრიპტოფანის დისრეგულაციასა და გლიკოლიზურ გზებს შორის ურთიერთქმედება, რომელიც დაფიქსირდა ამჟამინდელ კვლევაში. ცნობილია, რომ გახსნილი ნივთიერებების ტრანსპორტიორის მე-7 ოჯახის წევრი 5 (SLC7A5) არის ტრიპტოფანის ტრანსპორტიორი43,44,45. ქინოლინის მჟავას ფოსფორიბოზილტრანსფერაზა (QPRT) არის ფერმენტი, რომელიც მდებარეობს კინურენინის გზის ქვემოთ და გარდაქმნის ქინოლინის მჟავას NAMN46-ად. LUAD TCGA მონაცემთა ნაკრების შემოწმებამ აჩვენა, რომ როგორც SLC7A5, ასევე QPRT მნიშვნელოვნად მომატებული იყო სიმსივნურ ქსოვილში ნორმალურ ქსოვილთან შედარებით (სურ. 5ე). ეს ზრდა დაფიქსირდა ფილტვის ადენოკარცინომის I და II სტადიებში, ასევე III და IV სტადიებში (დამატებითი სურათი 11), რაც მიუთითებს ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმის ადრეულ დარღვევებზე, რომლებიც დაკავშირებულია სიმსივნის გენეზთან.
გარდა ამისა, LUAD-TCGA მონაცემთა ნაკრებმა აჩვენა დადებითი კორელაცია SLC7A5-სა და GAPDH mRNA ექსპრესიას შორის კიბოთი დაავადებული პაციენტების ნიმუშებში (r = 0.45, p = 1.55E-26, სურათი 5f). ამის საპირისპიროდ, ნორმალურ ფილტვის ქსოვილში ასეთ გენის ხელმოწერებს შორის მნიშვნელოვანი კორელაცია არ აღმოჩნდა (r = 0.25, p = 0.06, სურათი 5f). SLC7A5-ის ნოკდაუნმა (დამატებითი სურათი 12) A549 უჯრედებში მნიშვნელოვნად შეამცირა უჯრედული ტრიპტოფანის და NAD(H)2 დონეები (სურათი 5g,h), რამაც გამოიწვია გლიკოლიზური აქტივობის შესუსტება, რომელიც იზომება უჯრედგარე მჟავიანობის სიჩქარით (ECAR) (სურათი 1). 5i). ამრიგად, შრატში მეტაბოლური ცვლილებებისა და in vitro გამოვლენის საფუძველზე, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმმა შეიძლება წარმოქმნას NAD+ კინურენინის გზით და მნიშვნელოვანი როლი ითამაშოს გლიკოლიზის ხელშეწყობაში ფილტვის კიბოს დროს.
კვლევებმა აჩვენა, რომ LDCT-ით აღმოჩენილი გაურკვეველი ფილტვის კვანძების დიდი რაოდენობა შეიძლება გახდეს დამატებითი ტესტირების, როგორიცაა PET-CT, ფილტვის ბიოფსია და ჭარბი მკურნალობის საჭიროება ავთვისებიანი სიმსივნის ცრუ დადებითი დიაგნოზის გამო.31 როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 6-ში, ჩვენმა კვლევამ გამოავლინა შრატის მეტაბოლიტების პანელი პოტენციური დიაგნოსტიკური მნიშვნელობით, რამაც შეიძლება გააუმჯობესოს რისკის სტრატიფიკაცია და შემდგომი მართვა კომპიუტერული ტომოგრაფიით აღმოჩენილი ფილტვის კვანძების მიმართ.
ფილტვის კვანძების შეფასება ხდება დაბალი დოზით კომპიუტერული ტომოგრაფიის (LDCT) გამოყენებით, რომლის ვიზუალიზაციის ნიშნებიც მიუთითებს კეთილთვისებიან ან ავთვისებიან მიზეზებზე. კვანძების გაურკვეველმა შედეგმა შეიძლება გამოიწვიოს ხშირი დაკვირვება, არასაჭირო ჩარევები და ჭარბი მკურნალობა. დიაგნოსტიკური ღირებულების მქონე შრატის მეტაბოლური კლასიფიკატორების ჩართვამ შეიძლება გააუმჯობესოს რისკის შეფასება და ფილტვის კვანძების შემდგომი მართვა. PET პოზიტრონ-ემისიური ტომოგრაფია.
აშშ-ის NLST კვლევისა და ევროპული NELSON კვლევის მონაცემები მიუთითებს, რომ მაღალი რისკის ჯგუფების დაბალი დოზით კომპიუტერული ტომოგრაფიით (LDCT) სკრინინგმა შესაძლოა შეამციროს ფილტვის კიბოთი გამოწვეული სიკვდილიანობა1,3. თუმცა, LDCT-ით აღმოჩენილი შემთხვევითი ფილტვის კვანძების დიდი რაოდენობის რისკის შეფასება და შემდგომი კლინიკური მართვა კვლავ ყველაზე რთულ ამოცანად რჩება. მთავარი მიზანია LDCT-ზე დაფუძნებული არსებული პროტოკოლების სწორი კლასიფიკაციის ოპტიმიზაცია საიმედო ბიომარკერების ჩართვით.
გარკვეული მოლეკულური ბიომარკერები, როგორიცაა სისხლის მეტაბოლიტები, იდენტიფიცირებული იქნა ფილტვის კიბოს ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით15,17. ამ კვლევაში ჩვენ ყურადღება გავამახვილეთ შრატის მეტაბოლომიკის ანალიზის გამოყენებაზე, რათა განგვესაზღვრა LDCT-ით შემთხვევით აღმოჩენილი კეთილთვისებიანი და ავთვისებიანი ფილტვის კვანძები. UPLC-HRMS ანალიზის გამოყენებით შევადარეთ ჯანმრთელი კონტროლის (HC), კეთილთვისებიანი ფილტვის კვანძების (BN) და I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომის (LA) ნიმუშების გლობალური შრატის მეტაბოლომი. აღმოვაჩინეთ, რომ HC-ს და BN-ს მსგავსი მეტაბოლური პროფილები ჰქონდათ, მაშინ როდესაც LA-მ მნიშვნელოვანი ცვლილებები აჩვენა HC-სა და BN-თან შედარებით. ჩვენ გამოვავლინეთ შრატის მეტაბოლიტების ორი ნაკრები, რომლებიც განასხვავებენ LA-ს HC-სა და BN-სგან.
კეთილთვისებიანი და ავთვისებიანი კვანძების ამჟამინდელი LDCT-ზე დაფუძნებული იდენტიფიკაციის სქემა ძირითადად ეფუძნება კვანძების ზომას, სიმკვრივეს, მორფოლოგიას და დროთა განმავლობაში ზრდის ტემპს30. წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ კვანძების ზომა მჭიდრო კავშირშია ფილტვის კიბოს ალბათობასთან. მაღალი რისკის მქონე პაციენტებშიც კი, 6 მმ-ზე ნაკლები ზომის კვანძებში ავთვისებიანობის რისკი <1%-ია. 6-დან 20 მმ-მდე ზომის კვანძების ავთვისებიანობის რისკი 8%-დან 64%-მდე მერყეობს30. ამიტომ, ფლეიშნერის საზოგადოება რეკომენდაციას უწევს 6 მმ-იან ზღვრულ დიამეტრს რუტინული კომპიუტერული ტომოგრაფიის მონიტორინგისთვის.29 თუმცა, 6 მმ-ზე მეტი ზომის გაურკვეველი ფილტვის კვანძების (IPN) რისკის შეფასება და მართვა სათანადოდ არ არის ჩატარებული31. თანდაყოლილი გულის დაავადების ამჟამინდელი მართვა, როგორც წესი, ეფუძნება ფხიზელ ლოდინს ხშირი კომპიუტერული ტომოგრაფიული მონიტორინგით.
ვალიდირებული მეტაბოლომის საფუძველზე, ჩვენ პირველად ვაჩვენეთ მეტაბოლომიური ხელმოწერების გადაფარვა ჯანმრთელ პირებსა და <6 მმ ზომის კეთილთვისებიან კვანძებს შორის. ბიოლოგიური მსგავსება შეესაბამება კომპიუტერული ტომოგრაფიის წინა მონაცემებს, რომ <6 მმ ზომის კვანძების ავთვისებიანობის რისკი ისეთივე დაბალია, როგორც კვანძების არმქონე სუბიექტებისთვის.30 უნდა აღინიშნოს, რომ ჩვენი შედეგები ასევე აჩვენებს, რომ <6 მმ და ≥6 მმ კეთილთვისებიან კვანძებს აქვთ მაღალი მსგავსება მეტაბოლომიურ პროფილებში, რაც მიუთითებს, რომ კეთილთვისებიანი ეტიოლოგიის ფუნქციური განმარტება თანმიმდევრულია კვანძის ზომის მიუხედავად. ამრიგად, თანამედროვე დიაგნოსტიკური შრატის მეტაბოლიტების პანელები შეიძლება უზრუნველყოფენ ერთ ანალიზს, როგორც გამორიცხვის ტესტს, როდესაც კვანძები თავდაპირველად გამოვლენილია კომპიუტერული ტომოგრაფიით და პოტენციურად ამცირებენ სერიულ მონიტორინგს. ამავდროულად, მეტაბოლური ბიომარკერების იგივე პანელი განასხვავებს ≥6 მმ ზომის ავთვისებიან კვანძებს კეთილთვისებიანი კვანძებისგან და იძლევა ზუსტ პროგნოზებს მსგავსი ზომის IPN-ებისთვის და ბუნდოვანი მორფოლოგიური მახასიათებლებისთვის კომპიუტერული ტომოგრაფიის სურათებზე. შრატის მეტაბოლიზმის ეს კლასიფიკატორი კარგად პროგნოზირებდა ≥6 მმ ზომის კვანძების ავთვისებიანობას AUC-ის 0.927-ით. ჩვენი შედეგები ერთად აღებული მიუთითებს, რომ შრატის უნიკალური მეტაბოლომიური ხელმოწერები შესაძლოა სპეციფიკურად ასახავდეს სიმსივნის ადრეულ გამოწვეულ მეტაბოლურ ცვლილებებს და ჰქონდეს პოტენციური ღირებულება, როგორც რისკის პროგნოზირების ფაქტორები, კვანძის ზომისგან დამოუკიდებლად.
აღსანიშნავია, რომ ფილტვის ადენოკარცინომა (LUAD) და ბრტყელუჯრედოვანი კარცინომა (LUSC) არაწვრილუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს (NSCLC) ძირითადი ტიპებია. იმის გათვალისწინებით, რომ LUSC მჭიდრო კავშირშია თამბაქოს მოხმარებასთან47 და LUAD არის კომპიუტერული ტომოგრაფიით სკრინინგზე გამოვლენილი შემთხვევითი ფილტვის კვანძების ყველაზე გავრცელებული ჰისტოლოგია48, ჩვენი კლასიფიკატორის მოდელი სპეციალურად შეიქმნა I სტადიის ადენოკარცინომის ნიმუშებისთვის. ვანგმა და მისმა კოლეგებმა ასევე ყურადღება გაამახვილეს LUAD-ზე და ლიპიდომიკის გამოყენებით ცხრა ლიპიდური ხელმოწერა გამოავლინეს ფილტვის კიბოს ადრეული სტადიის ჯანმრთელი პირებისგან გასარჩევად17. ჩვენ გამოვცადეთ მიმდინარე კლასიფიკატორის მოდელი I სტადიის LUSC-ის 16 შემთხვევაზე და 74 კეთილთვისებიან კვანძზე და დავაკვირდით LUSC-ის პროგნოზირების დაბალ სიზუსტეს (AUC 0.776), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ LUAD-ს და LUSC-ს შეიძლება ჰქონდეთ საკუთარი მეტაბოლომიური ხელმოწერები. მართლაც, ნაჩვენებია, რომ LUAD და LUSC განსხვავდებიან ეტიოლოგიით, ბიოლოგიური წარმოშობით და გენეტიკური აბერაციებით49. ამიტომ, სკრინინგის პროგრამებში ფილტვის კიბოს პოპულაციაზე დაფუძნებული გამოვლენის სასწავლო მოდელებში უნდა შევიდეს ჰისტოლოგიის სხვა ტიპები.
აქ ჩვენ გამოვავლინეთ ფილტვის ადენოკარცინომის ექვსი ყველაზე ხშირად შეცვლილი გზა ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფთან და კეთილთვისებიან კვანძებთან შედარებით. ქსანთინი და ჰიპოქსანტინი პურინის მეტაბოლური გზის გავრცელებული მეტაბოლიტებია. ჩვენი შედეგების შესაბამისად, პურინის მეტაბოლიზმთან დაკავშირებული შუალედური პროდუქტები მნიშვნელოვნად გაიზარდა ფილტვის ადენოკარცინომის მქონე პაციენტების შრატში ან ქსოვილებში ჯანმრთელ საკონტროლო ჯგუფთან ან პრეინვაზიურ სტადიაზე მყოფ პაციენტებთან შედარებით15,50. შრატში ქსანტინის და ჰიპოქსანტინის მომატებული დონე შეიძლება ასახავდეს ანაბოლიზმს, რომელიც საჭიროა სწრაფად პროლიფერაციული კიბოს უჯრედებისთვის. გლუკოზის მეტაბოლიზმის დისრეგულაცია კიბოს მეტაბოლიზმის ცნობილი დამახასიათებელი ნიშანია51. აქ ჩვენ დავაკვირდით პირუვატის და ლაქტატის მნიშვნელოვან ზრდას LA ჯგუფში HC და BN ჯგუფთან შედარებით, რაც შეესაბამება არაწვრილუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს (NSCLC) მქონე პაციენტებისა და ჯანმრთელი საკონტროლო ჯგუფის შრატის მეტაბოლომების პროფილებში გლიკოლიზური გზის ანომალიების შესახებ წინა ცნობებს. შედეგები თანმიმდევრულია52,53.
მნიშვნელოვანია, რომ ფილტვის ადენოკარცინომების შრატში პირუვატისა და ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმს შორის უკუკორელაცია დავაკვირდით. შრატის ტრიპტოფანის დონე შემცირებული იყო LA ჯგუფში HC ან BN ჯგუფთან შედარებით. საინტერესოა, რომ პერსპექტიული კოჰორტის გამოყენებით ჩატარებულმა წინა მასშტაბურმა კვლევამ აჩვენა, რომ მოცირკულირე ტრიპტოფანის დაბალი დონე დაკავშირებული იყო ფილტვის კიბოს გაზრდილ რისკთან 54. ტრიპტოფანი არის აუცილებელი ამინომჟავა, რომელსაც მთლიანად საკვებიდან ვიღებთ. ჩვენ დავასკვნით, რომ ფილტვის ადენოკარცინომაში შრატის ტრიპტოფანის შემცირება შეიძლება ასახავდეს ამ მეტაბოლიტის სწრაფ შემცირებას. კარგად არის ცნობილი, რომ ტრიპტოფანის კატაბოლიზმის საბოლოო პროდუქტი კინურენინის გზით არის de novo NAD+ სინთეზის წყარო. რადგან NAD+ ძირითადად წარმოიქმნება გადარჩენის გზით, NAD+-ის მნიშვნელობა ტრიპტოფანის მეტაბოლიზმში ჯანმრთელობისა და დაავადების დროს ჯერ კიდევ გასარკვევია 46. TCGA მონაცემთა ბაზის ჩვენმა ანალიზმა აჩვენა, რომ ტრიპტოფანის ტრანსპორტიორის, გამხსნელი ტრანსპორტიორის 7A5 (SLC7A5) ექსპრესია მნიშვნელოვნად გაზრდილი იყო ფილტვის ადენოკარცინომაში ნორმალურ საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით და დადებითად კორელაციაში იყო გლიკოლიზური ფერმენტ GAPDH-ის ექსპრესიასთან. წინა კვლევები ძირითადად ფოკუსირებული იყო ტრიპტოფანის კატაბოლიზმის როლზე სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნური პასუხის დათრგუნვაში40,41,42. აქ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ ფილტვის კიბოს უჯრედებში ტრიპტოფანის შთანთქმის დათრგუნვა SLC7A5-ის ნოკდაუნით იწვევს უჯრედული NAD დონის შემდგომ შემცირებას და გლიკოლიზური აქტივობის თანმხლებ შესუსტებას. შეჯამებისთვის, ჩვენი კვლევა იძლევა ბიოლოგიურ საფუძველს შრატის მეტაბოლიზმის ცვლილებებისთვის, რომლებიც დაკავშირებულია ფილტვის ადენოკარცინომის ავთვისებიან ტრანსფორმაციასთან.
EGFR მუტაციები არაწვრილუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს მქონე პაციენტებში ყველაზე გავრცელებული მამოძრავებელი მუტაციებია. ჩვენს კვლევაში აღმოვაჩინეთ, რომ EGFR მუტაციის მქონე პაციენტებს (n = 41) ჰქონდათ საერთო მეტაბოლომიური პროფილები ველური ტიპის EGFR-ის მქონე პაციენტების მსგავსი (n = 31), თუმცა აცილკარნიტინის მქონე პაციენტებში ზოგიერთ EGFR მუტანტ პაციენტში შრატის დონის შემცირება აღმოვაჩინეთ. აცილკარნიტინების დადგენილი ფუნქციაა აცილის ჯგუფების ტრანსპორტირება ციტოპლაზმიდან მიტოქონდრიულ მატრიქსში, რაც იწვევს ცხიმოვანი მჟავების დაჟანგვას ენერგიის წარმოსაქმნელად55. ჩვენი დასკვნების შესაბამისად, ბოლოდროინდელმა კვლევამ ასევე გამოავლინა მსგავსი მეტაბოლომების პროფილები EGFR მუტანტსა და EGFR ველური ტიპის სიმსივნეებს შორის ფილტვის ადენოკარცინომის 102 ქსოვილის ნიმუშის გლობალური მეტაბოლომის ანალიზით50. საინტერესოა, რომ აცილკარნიტინის შემცველობა ასევე აღმოჩნდა EGFR მუტანტის ჯგუფში. ამიტომ, ასახავს თუ არა აცილკარნიტინის დონის ცვლილებები EGFR-ით გამოწვეულ მეტაბოლურ ცვლილებებს და ძირითად მოლეკულურ გზებს, შეიძლება საჭირო გახდეს შემდგომი კვლევის ჩატარება.
დასკვნის სახით, ჩვენი კვლევა აყალიბებს შრატის მეტაბოლურ კლასიფიკატორს ფილტვის კვანძების დიფერენციალური დიაგნოზისთვის და გვთავაზობს სამუშაო პროცესს, რომელსაც შეუძლია რისკის შეფასების ოპტიმიზაცია და კლინიკური მართვის ხელშეწყობა კომპიუტერული ტომოგრაფიის სკრინინგის საფუძველზე.
ეს კვლევა დამტკიცებული იყო სუნ იატსენის უნივერსიტეტის კიბოს საავადმყოფოს ეთიკის კომიტეტის, სუნ იატსენის უნივერსიტეტის პირველი შვილობილი საავადმყოფოს და ჟენჯოუს უნივერსიტეტის კიბოს საავადმყოფოს ეთიკის კომიტეტის მიერ. აღმოჩენისა და შიდა ვალიდაციის ჯგუფებში შეგროვდა ჯანმრთელი პირების 174 შრატი და კეთილთვისებიანი კვანძების 244 შრატი იმ პირებისგან, რომლებიც ყოველწლიურ სამედიცინო შემოწმებას გადიოდნენ სუნ იატსენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრში, კიბოს კონტროლისა და პრევენციის დეპარტამენტში, და 166 კეთილთვისებიანი კვანძი. I სტადიის ფილტვის ადენოკარცინომა შეგროვდა სუნ იატსენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრიდან. გარე ვალიდაციის კოჰორტაში იყო კეთილთვისებიანი კვანძების 48 შემთხვევა, სუნ იატსენის უნივერსიტეტის პირველ შვილობილ საავადმყოფოში ფილტვის I სტადიის ადენოკარცინომის 39 შემთხვევა და ჟენჯოუს კიბოს საავადმყოფოდან ფილტვის I სტადიის ადენოკარცინომის 24 შემთხვევა. სუნ იატსენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრმა ასევე შეაგროვა I სტადიის ბრტყელუჯრედოვანი ფილტვის კიბოს 16 შემთხვევა, რათა შემოწმებულიყო დადგენილი მეტაბოლური კლასიფიკატორის დიაგნოსტიკური უნარი (პაციენტის მახასიათებლები ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში 5). აღმოჩენის კოჰორტიდან და შიდა ვალიდაციის კოჰორტიდან ნიმუშები შეგროვდა 2018 წლის იანვრიდან 2020 წლის მაისამდე პერიოდში. გარე ვალიდაციის კოჰორტიდან ნიმუშები შეგროვდა 2021 წლის აგვისტოდან 2022 წლის ოქტომბრამდე პერიოდში. გენდერული დისკრიმინაციის მინიმიზაციის მიზნით, თითოეულ კოჰორტას დაახლოებით თანაბარი რაოდენობის მამაკაცი და ქალი შემთხვევა მიენიჭა. აღმოჩენის გუნდი და შიდა მიმოხილვის გუნდი. მონაწილის სქესი განისაზღვრა თვითშეფასების საფუძველზე. ყველა მონაწილისგან მიღებული იქნა ინფორმირებული თანხმობა და კომპენსაცია არ იყო გათვალისწინებული. კეთილთვისებიანი კვანძების მქონე სუბიექტები იყვნენ ისინი, ვისაც ანალიზის დროს 2-დან 5 წლამდე ასაკში სტაბილური კომპიუტერული ტომოგრაფიის ქულა ჰქონდათ, გარდა გარე ვალიდაციის ნიმუშიდან აღებული 1 შემთხვევისა, რომელიც ოპერაციამდე შეგროვდა და დიაგნოზი ჰისტოპათოლოგიით დაუსვეს. ქრონიკული ბრონქიტის გარდა. ფილტვის ადენოკარცინომის შემთხვევები შეგროვდა ფილტვის რეზექციამდე და დადასტურდა პათოლოგიური დიაგნოზით. უზმოზე აღებული სისხლის ნიმუშები შეგროვდა შრატის გამყოფ მილებში ანტიკოაგულანტების გარეშე. სისხლის ნიმუშები შედედდა 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე და შემდეგ ცენტრიფუგირდა 2851 × g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე შრატის სუპერნატანტის შესაგროვებლად. შრატის ალიკვოტები გაიყინა -80°C ტემპერატურაზე მეტაბოლიტების ექსტრაქციამდე. სუნ იატ-სენის უნივერსიტეტის კიბოს ცენტრის კიბოს პრევენციისა და სამედიცინო გამოკვლევის დეპარტამენტმა შეაგროვა შრატის ჯგუფი 100 ჯანმრთელი დონორისგან, მათ შორის 40-დან 55 წლამდე ასაკის მამაკაცებისა და ქალების თანაბარი რაოდენობისგან. თითოეული დონორის ნიმუშის თანაბარი მოცულობები აირია, მიღებული ჯგუფი დაიყო ალიკვოტირებულად და შეინახეს -80°C ტემპერატურაზე. შრატის ნარევი გამოყენებული იქნა როგორც საცნობარო მასალა ხარისხის კონტროლისა და მონაცემთა სტანდარტიზაციისთვის.
საცნობარო შრატი და სატესტო ნიმუშები გალღობეს და მეტაბოლიტები ექსტრაქციული იქნა კომბინირებული ექსტრაქციის მეთოდით (MTBE/მეთანოლი/წყალი)56. მოკლედ, შრატის 50 μl შეერია 225 μl ყინულივით ცივ მეთანოლს და 750 μl ყინულივით ცივ მეთილ ტერტ-ბუტილ ეთერს (MTBE). ნარევი მოურიეთ და ინკუბირებული იყო ყინულზე 1 საათის განმავლობაში. შემდეგ ნიმუშები შეერია და მორევივით შეერია 188 μl MS კლასის წყალს, რომელიც შეიცავდა შიდა სტანდარტებს (13C-ლაქტატი, 13C3-პირუვატი, 13C-მეთიონინი და 13C6-იზოლეიცინი, შეძენილი Cambridge Isotope Laboratories-ისგან). ნარევი შემდეგ ცენტრიფუგირდა 15,000 × g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე და ქვედა ფაზა გადაიტანეს ორ მილში (თითოეული 125 μL) LC-MS ანალიზისთვის დადებით და უარყოფით რეჟიმებში. დაბოლოს, ნიმუში აორთქლდა გაშრობამდე მაღალსიჩქარიან ვაკუუმურ კონცენტრატორში.
გამხმარი მეტაბოლიტები აღდგენილი იქნა 120 μl 80%-იან აცეტონიტრილში, მოურიეთ 5 წუთის განმავლობაში და დაცენტრიფუგირებული იქნა 15,000 × g-ზე 10 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. ზედა ფენა გადატანილი იქნა ქარვისფერ შუშის ფლაკონებში მიკროჩანართებით მეტაბოლომიკის კვლევებისთვის. არამიზნობრივი მეტაბოლომიკის ანალიზი ულტრაეფექტური თხევადი ქრომატოგრაფიის-მაღალი გარჩევადობის მას-სპექტრომეტრიის (UPLC-HRMS) პლატფორმაზე. მეტაბოლიტები გამოიყო Dionex Ultimate 3000 UPLC სისტემის და ACQUITY BEH ამიდური სვეტის (2.1 × 100 მმ, 1.7 μm, Waters) გამოყენებით. დადებითი იონების რეჟიმში, მობილური ფაზები იყო 95% (A) და 50% აცეტონიტრილი (B), თითოეული შეიცავდა 10 მმოლ/ლ ამონიუმის აცეტატს და 0.1% ჭიანჭველმჟავას. უარყოფით რეჟიმში, მობილური ფაზები A და B შეიცავდა შესაბამისად 95% და 50% აცეტონიტრილს, ორივე ფაზა შეიცავდა 10 მმოლ/ლ ამონიუმის აცეტატს, pH = 9. გრადიენტის პროგრამა შემდეგი იყო: 0–0.5 წთ, 2% B; 0.5–12 წთ, 2–50% B; 12–14 წთ, 50–98% B; 14–16 წთ, 98% B; 16–16.1 წთ, 98–2% B; 16.1–20 წთ, 2% B. სვეტი შენარჩუნებული იყო 40°C-ზე, ხოლო ნიმუში - 10°C-ზე ავტოსემპლერში. ნაკადის სიჩქარე იყო 0.3 მლ/წთ, ინექციის მოცულობა იყო 3 μl. Q-Exactive Orbitrap მას-სპექტრომეტრი (Thermo Fisher Scientific) ელექტროშესხურების იონიზაციის (ESI) წყაროთი მუშაობდა სრული სკანირების რეჟიმში და დაკავშირებული იყო ddMS2 მონიტორინგის რეჟიმთან მონაცემების დიდი მოცულობის შესაგროვებლად. MS პარამეტრები დაყენებული იყო შემდეგნაირად: შესხურების ძაბვა +3.8 კვ/- 3.2 კვ, კაპილარული ტემპერატურა 320°C, დამცავი აირი 40 arb, დამხმარე აირი 10 arb, ზონდის გამათბობლის ტემპერატურა 350°C, სკანირების დიაპაზონი 70–1050 მ/სთ, გარჩევადობა 70 000. მონაცემები მიღებული იქნა Xcalibur 4.1-ის (Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით.
მონაცემთა ხარისხის შესაფასებლად, თითოეული ნიმუშიდან სუპერნატანტის 10 μL ალიკვოტების ამოღებით შეიქმნა გაერთიანებული ხარისხის კონტროლის (QC) ნიმუშები. UPLC-MS სისტემის სტაბილურობის შესაფასებლად ანალიტიკური თანმიმდევრობის დასაწყისში გაანალიზდა ხარისხის კონტროლის ნიმუშის ექვსი ინექცია. შემდეგ, პერიოდულად, პარტიაში შეჰყავთ ხარისხის კონტროლის ნიმუშები. ამ კვლევაში შრატის ნიმუშების 11-ვე პარტია გაანალიზდა LC-MS-ით. 100 ჯანმრთელი დონორისგან აღებული შრატის პულის ნარევის ალიკვოტები გამოყენებულ იქნა შესაბამის პარტიებში საცნობარო მასალად ექსტრაქციის პროცესის მონიტორინგისა და პარტიებს შორის ეფექტების კორექტირებისთვის. აღმოჩენის კოჰორტის, შიდა ვალიდაციის კოჰორტის და გარე ვალიდაციის კოჰორტის არამიზნობრივი მეტაბოლომიკის ანალიზი ჩატარდა სუნ იატ-სენის უნივერსიტეტის მეტაბოლომიკის ცენტრში. გუანდუნგის ტექნოლოგიური უნივერსიტეტის ანალიზისა და ტესტირების ცენტრის გარე ლაბორატორიამ ასევე გააანალიზა გარე კოჰორტის 40 ნიმუში კლასიფიკატორის მოდელის მუშაობის შესამოწმებლად.
ექსტრაქციისა და გახსნის შემდეგ, შრატის მეტაბოლიტების აბსოლუტური რაოდენობრივი განსაზღვრა განხორციელდა ულტრამაღალი ეფექტურობის თხევადი ქრომატოგრაფიისა და ტანდემური მას-სპექტრომეტრიის (Agilent 6495 სამმაგი კვადრუპოლური) გამოყენებით ელექტროსპრეის იონიზაციის (ESI) წყაროთი მრავალჯერადი რეაქციის მონიტორინგის (MRM) რეჟიმში. მეტაბოლიტების გამოსაყოფად გამოყენებული იქნა ACQUITY BEH ამიდური სვეტი (2.1 × 100 მმ, 1.7 μm, Waters). მობილური ფაზა შედგებოდა 90% (A) და 5% აცეტონიტრილისგან (B) 10 მმოლ/ლ ამონიუმის აცეტატით და 0.1% ამიაკის ხსნარით. გრადიენტის პროგრამა შემდეგი იყო: 0–1.5 წთ, 0% B; 1.5–6.5 წთ, 0–15% B; 6.5–8 წთ, 15% B; 8–8.5 წთ, 15%–0% B; 8.5–11.5 წთ, 0% B. ავტოსემპლერში სვეტი შენარჩუნებული იყო 40°C-ზე, ხოლო ნიმუში - 10°C-ზე. ნაკადის სიჩქარე იყო 0.3 მლ/წთ, ხოლო ინექციის მოცულობა - 1 μL. MS პარამეტრები დაყენებული იყო შემდეგნაირად: კაპილარული ძაბვა ±3.5 კვ, ნებულაიზერის წნევა 35 psi, გარსის გაზის ნაკადი 12 ლ/წთ, გარსის გაზის ტემპერატურა 350°C, საშრობი გაზის ტემპერატურა 250°C და საშრობი გაზის ნაკადი 14 ლ/წთ. ტრიპტოფანის, პირუვატის, ლაქტატის, ჰიპოქსანტინის და ქსანტინის MRM კონვერსიები იყო შესაბამისად 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 და 151.0–107.9. მონაცემები შეგროვდა Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies) გამოყენებით. შრატის ნიმუშებისთვის ტრიპტოფანი, პირუვატი, ლაქტატი, ჰიპოქსანტინი და ქსანტინი განისაზღვრა სტანდარტული ნარევის ხსნარების კალიბრაციის მრუდების გამოყენებით. უჯრედული ნიმუშებისთვის ტრიპტოფანის შემცველობა ნორმალიზებული იყო შიდა სტანდარტისა და უჯრედული ცილის მასის მიხედვით.
პიკის ექსტრაქცია (m/z და შეკავების დრო (RT)) ჩატარდა Compound Discovery 3.1-ისა და TraceFinder 4.0-ის (Thermo Fisher Scientific) გამოყენებით. პარტიებს შორის პოტენციური განსხვავებების აღმოსაფხვრელად, სატესტო ნიმუშის თითოეული დამახასიათებელი პიკი გაიყო იმავე პარტიიდან აღებული საცნობარო მასალის დამახასიათებელ პიკზე, რათა მიგვეღო ფარდობითი სიმრავლე. შიდა სტანდარტების ფარდობითი სტანდარტული გადახრები სტანდარტიზაციამდე და მის შემდეგ ნაჩვენებია დამატებით ცხრილში 6. ორ ჯგუფს შორის განსხვავებები დახასიათდა ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებლით (FDR <0.05, Wilcoxon-ის ნიშან-თვისების რანგის ტესტი) და ნაკეცის ცვლილებით (>1.2 ან <0.83). ექსტრაგირებული მახასიათებლების ნედლი MS მონაცემები და საცნობარო შრატით კორექტირებული MS მონაცემები ნაჩვენებია შესაბამისად დამატებით მონაცემებში 1 და დამატებით მონაცემებში 2. პიკის ანოტაცია ჩატარდა იდენტიფიკაციის ოთხი განსაზღვრული დონის საფუძველზე, მათ შორის იდენტიფიცირებული მეტაბოლიტები, სავარაუდო ანოტირებული ნაერთები, სავარაუდო დახასიათებული ნაერთების კლასები და უცნობი ნაერთები 22. Compound Discovery 3.1-ში (mzCloud, HMDB, Chemspider) მონაცემთა ბაზაში ძიების საფუძველზე, საბოლოოდ შეირჩა ბიოლოგიური ნაერთები MS/MS შესატყვისი დადასტურებული სტანდარტებით ან mzCloud-ში ზუსტი შესატყვისი ანოტაციებით (ქულა > 85) ან Chemspider-ში, როგორც შუალედური პროდუქტები დიფერენციალურ მეტაბოლომებს შორის. თითოეული მახასიათებლის პიკური ანოტაციები მოცემულია დამატებით მონაცემებში 3. MetaboAnalyst 5.0 გამოყენებული იქნა ჯამური ნორმალიზებული მეტაბოლიტების სიმრავლის უნივარიაციული ანალიზისთვის. MetaboAnalyst 5.0-მა ასევე შეაფასა KEGG გზის გამდიდრების ანალიზი მნიშვნელოვნად განსხვავებულ მეტაბოლიტებზე დაყრდნობით. ძირითადი კომპონენტების ანალიზი (PCA) და ნაწილობრივი უმცირესი კვადრატების დისკრიმინანტული ანალიზი (PLS-DA) გაანალიზდა ropls პროგრამული პაკეტის (v.1.26.4) გამოყენებით, დასტის ნორმალიზებით და ავტომასკალირებით. კვანძების ავთვისებიანობის პროგნოზირების ოპტიმალური მეტაბოლიტის ბიომარკერის მოდელი გენერირებული იქნა ბინარული ლოგისტიკური რეგრესიის გამოყენებით უმცირესი აბსოლუტური შეკუმშვით და შერჩევის ოპერატორით (LASSO, R პაკეტი v.4.1-3). დისკრიმინანტული მოდელის მუშაობა დეტექციისა და ვალიდაციის ნაკრებებში დახასიათდა AUC-ის შეფასებით ROC ანალიზის საფუძველზე pROC პაკეტის (v.1.18.0.) მიხედვით. ოპტიმალური ალბათობის ზღვარი მიღებული იქნა მოდელის მაქსიმალური იუდენის ინდექსის საფუძველზე (მგრძნობელობა + სპეციფიკურობა – 1). ნიმუშები, რომელთა მნიშვნელობები ზღურბლზე ნაკლები ან მეტია, შესაბამისად, პროგნოზირებული იქნება, როგორც კეთილთვისებიანი კვანძები და ფილტვის ადენოკარცინომა.
A549 უჯრედები (#CCL-185, American Type Culture Collection) გაიზარდა F-12K გარემოში, რომელიც შეიცავდა 10% FBS-ს. მოკლე თმის სამაგრი რნმ-ის (shRNA) თანმიმდევრობები, რომლებიც მიზნად ისახავდა SLC7A5-ს და არასამიზნე კონტროლს (NC), შეიყვანეს ლენტივირუსულ ვექტორ pLKO.1-puro-ში. shSLC7A5-ის ანტისენს თანმიმდევრობებია: Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). SLC7A5-ის (#5347) და ტუბულინის (#2148) ანტისხეულები შეძენილი იქნა Cell Signaling Technology-ისგან. SLC7A5-ის და ტუბულინის ანტისხეულები გამოყენებული იქნა 1:1000 განზავებით Western blot ანალიზისთვის.
Seahorse XF გლიკოლიზური სტრეს-ტესტი ზომავს უჯრედგარე მჟავიანობის (ECAR) დონეს. ანალიზში, უჯრედული გლიკოლიზური უნარის შესამოწმებლად, რომელიც ECAR-ით იზომებოდა, თანმიმდევრულად შეჰყავდათ გლუკოზა, ოლიგომიცინ A და 2-DG.
A549 უჯრედები, რომლებიც ტრანსფექტირებული იყო არასამიზნე კონტროლით (NC) და shSLC7A5-ით (Sh1, Sh2), ღამით მოათავსეს 10 სმ დიამეტრის ჭურჭელში. უჯრედის მეტაბოლიტები ექსტრაგირებული იქნა 1 მლ ყინულივით ცივი 80%-იანი წყალხსნარი მეთანოლით. მეთანოლის ხსნარში არსებული უჯრედები გაფხეკეს, შეგროვდა ახალ მილში და დაცენტრიფუგდა 15,000 × g-ზე 15 წუთის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე. შეაგროვეს 800 µლ სუპერნატანტი და გააშრეს მაღალსიჩქარიანი ვაკუუმური კონცენტრატორის გამოყენებით. გამხმარი მეტაბოლიტების გრანულები შემდეგ გაანალიზდა ტრიპტოფანის დონეზე LC-MS/MS-ის გამოყენებით, როგორც ზემოთ იყო აღწერილი. A549 უჯრედებში (NC და shSLC7A5) უჯრედული NAD(H) დონეები გაიზომა რაოდენობრივი NAD+/NADH კოლორიმეტრიული ნაკრების (#K337, BioVision) გამოყენებით მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად. ცილის დონე გაიზომა თითოეული ნიმუშისთვის მეტაბოლიტების რაოდენობის ნორმალიზების მიზნით.
ნიმუშის ზომის წინასწარი დასადგენად სტატისტიკური მეთოდები არ გამოუყენებიათ. ბიომარკერების აღმოჩენისკენ მიმართული წინა მეტაბოლომიკის კვლევები15,18 განხილული იქნა ზომის განსაზღვრის საორიენტაციო ნიშნულებად და ამ ანგარიშებთან შედარებით, ჩვენი ნიმუში ადეკვატური იყო. კვლევის კოჰორტიდან არცერთი ნიმუში არ გამოირიცხა. შრატის ნიმუშები შემთხვევითობის პრინციპით გადანაწილდა აღმოჩენის ჯგუფში (306 შემთხვევა, 74.6%) და შიდა ვალიდაციის ჯგუფში (104 შემთხვევა, 25.4%) არამიზნობრივი მეტაბოლომიკის კვლევებისთვის. ჩვენ ასევე შემთხვევითობის პრინციპით შევარჩიეთ 70 შემთხვევა თითოეული ჯგუფიდან მიზნობრივი მეტაბოლომიკის კვლევების აღმოჩენების ნაკრებიდან. მკვლევარები ბრმად იყვნენ ინფორმირებულნი ჯგუფური მინიჭების შესახებ LC-MS მონაცემების შეგროვებისა და ანალიზის დროს. მეტაბოლომიკის მონაცემებისა და უჯრედული ექსპერიმენტების სტატისტიკური ანალიზი აღწერილია შესაბამის განყოფილებებში „შედეგები“, „სურათების ლეგენდები“ და „მეთოდები“. უჯრედული ტრიპტოფანის, NADT-ის და გლიკოლიზური აქტივობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ჩატარდა სამჯერ დამოუკიდებლად იდენტური შედეგებით.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ ამ სტატიასთან დაკავშირებული ბუნებრივი პორტფოლიოს ანგარიშის რეზიუმე.
ექსტრაგირებული მახასიათებლების ნედლი MS მონაცემები და საცნობარო შრატის ნორმალიზებული MS მონაცემები ნაჩვენებია, შესაბამისად, დამატებით მონაცემებში 1 და დამატებით მონაცემებში 2. დიფერენციალური მახასიათებლების პიკური ანოტაციები წარმოდგენილია დამატებით მონაცემებში 3. LUAD TCGA მონაცემთა ნაკრების ჩამოტვირთვა შესაძლებელია https://portal.gdc.cancer.gov/-დან. გრაფიკის აგებისთვის შეყვანის მონაცემები მოცემულია წყაროს მონაცემებში. ამ სტატიისთვის მოცემულია წყაროს მონაცემები.
ფილტვის სკრინინგის ეროვნული კვლევის ჯგუფი და ა.შ. ფილტვის კიბოთი გამოწვეული სიკვდილიანობის შემცირება დაბალი დოზით კომპიუტერული ტომოგრაფიით. ჩრდილოეთ ინგლისი. J. Med. 365, 395–409 (2011).
კრამერი, BS, ბერგი, KD, აბერლე, DR და პროფეტი, PC ფილტვის კიბოს სკრინინგი დაბალი დოზით სპირალური კომპიუტერული ტომოგრაფიის გამოყენებით: ფილტვების ეროვნული სკრინინგის კვლევის (NLST) შედეგები. J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
დე კონინგი, ჰ.ჯ. და სხვ. ფილტვის კიბოთი გამოწვეული სიკვდილიანობის შემცირება მოცულობითი კომპიუტერული ტომოგრაფიის სკრინინგის გამოყენებით რანდომიზებულ კვლევაში. ჩრდილოეთ ინგლისი. J. Med. 382, ​​503–513 (2020).