CRISPR) არის მესამე თაობის გენომის რედაქტირების ტექნიკა: CRISPR-მა რევოლუცია მოახდინა მსოფლიოში

კლასტერული რეგულარულად ინტერვალირებული მოკლე პალინდრომული გამეორებები (CRISPR) არის მესამე თაობის გენომის რედაქტირების ტექნიკა, რომელმაც რევოლუცია მოახდინა მსოფლიოში თავისი მაღალი გამტარუნარიანობის შედეგებით. იგი გამოიყენება სხვადასხვა ბიოლოგიური დაავადებებისა და ინფექციების სამკურნალოდ. სხვადასხვა ბაქტერიას და სხვა პროკარიოტებს (მაგალითად, არქეებს) ასევე აქვთ CRISPR/Cas9 სისტემები ფაგებისგან დასაცავად. ცნობილია, რომ CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებულ სტრატეგიებს შეუძლიათ შეაფერხონ სამმაგი უარყოფითი სარძევე ჯირკვლის კიბოს (TNBC) ზრდა და პროგრესირება პოტენციურად შეცვლილი რეზისტენტობის გენების, ტრანსკრიფციისა და ეპიგენეტიკური რეგულაციის დამიზნებით. ეს თერაპიული ჩარევები შეიძლება დაეხმაროს ისეთი რთული პრობლემების მოგვარებას, როგორიცაა წამლისმიერი რეზისტენტობა, რომელიც შეინიშნება TNBC-შიც კი. ამჟამად, CRISPR/Cas9-ის სამიზნე უჯრედებში მიწოდების სხვადასხვა მეთოდი გამოიყენება, როგორიცაა ფიზიკური (მიკროინექცია, ელექტროპორაცია და ჰიდროდინამიკური რეჟიმები), ვირუსული (ადენოასოცირებული ვირუსი და ლენტივირუსი) და არავირუსული (ლიპოსომები და ლიპიდური ნანონაწილაკები). მიუხედავად იმისა, რომ ტრანსცხიმოვანი კიბოს მოლეკულური მიზეზების შესასწავლად სხვადასხვა მოდელი შემუშავდა, გენომის რედაქტირების ინსტრუმენტების in vivo მიწოდების მგრძნობიარე და მიზანმიმართული მეთოდების ნაკლებობა ზღუდავს მათ კლინიკურ გამოყენებას. შეჯამებისთვის, ეს მიმოხილვა ყოვლისმომცველად იკვლევს ტრანსცხიმოვანი კიბოს CRISPR/Cas9 მკურნალობის პროგრესს, გამოწვევებს, შეზღუდვებსა და პერსპექტივებს არსებულ მტკიცებულებებზე დაყრდნობით. ჩვენ ასევე ხაზს ვუსვამთ, თუ როგორ შეუძლია ხელოვნური ინტელექტისა და მანქანური სწავლების კომბინაციას გააუმჯობესოს CRISPR/Cas9 სტრატეგიები ტრანსცხიმოვანი კიბოს მკურნალობაში.
კიბო ხასიათდება უჯრედების უკონტროლო დაყოფით, უჯრედული ციკლის საკონტროლო წერტილების დარღვევით და სიმსივნის სუპრესორული გენების (TSG) მუტაციებით (Matthews et al., 2022). კიბოს სხვადასხვა ტიპს შორის, ძუძუს კიბო ქალებში კიბოს ყველაზე გავრცელებული სახეობაა და მსოფლიოში მაღალი სიკვდილიანობის მაჩვენებლით ხასიათდება (Waks and Winer, 2019). ძუძუს კიბო ჰეტეროგენული დაავადებაა მრავალფეროვანი მახასიათებლებით, როგორიცაა ჰისტოლოგიური და ბიოლოგიური მახასიათებლები, კლინიკური სურათი და ქცევა, და მკურნალობაზე რეაგირება (Weigelt et al., 2010). ძუძუს კიბოს კლასიფიკაცია ზუსტ ინფორმაციას იძლევა ძუძუს კიბოს დიაგნოზისა და სიმსივნის პროგნოზისთვის. საერთო ბიომარკერების და კლინიკურ-პათოლოგიური მახასიათებლების გამოყენება ძუძუს კიბოს კლასიფიკაციის მთავარი კრიტერიუმი იყო (Tsang and Tse, 2019). ძუძუს კიბოს პროგნოზსა და მკურნალობაზე რეაგირებაზე გავლენას ახდენს მრავალი ფაქტორი, მათ შორის ესტროგენის რეცეპტორის (ER), პროგესტერონის რეცეპტორის (PR), ადამიანის ეპიდერმული ზრდის ფაქტორის რეცეპტორი 2-ის (HER2/neu) არსებობა და ჰისტოლოგიური ხარისხი, სიმსივნის ტიპი და ხარისხი. ზომა და ლიმფური კვანძების მეტასტაზირება (ალ-ტუბაიტი, 2020). იდენტიფიცირებულია სარძევე ჯირკვლის კიბოს ხუთი შინაგანი მოლეკულური ქვეტიპი, მათ შორის სანათური A, სანათური B, HER2-ით გამდიდრებული, ბაზალური მსგავსი და კლაუდინ-ლოუ (პრატი და სხვ., 2015). TNBC არის კიბოს მოლეკულური ქვეტიპი, რომელიც არ გამოხატავს ყველა ER, PR და HER2-ს (იინი და სხვ., 2020). ეს პათოლოგიური მახასიათებლები ასოცირდება TNBC-თან, რაც ადასტურებს მის სწრაფ პროგრესირებას და უფრო აგრესიულ ბუნებას, ვიდრე სარძევე ჯირკვლის კიბოს ნებისმიერი სხვა ტიპი (ფენგი და სხვ., 2018). გარდა ამისა, პერუ და სხვ. (2000) გამოიყენეს მიკროჩიპების ტექნოლოგია სარძევე ჯირკვლის კიბოს რეკლასიფიკაციისა და სარძევე ჯირკვლის კიბოს ხუთი შინაგანი ქვეტიპის იდენტიფიცირებისთვის (კადენასი, 2012). ბაზალური მსგავსი სარძევე ჯირკვლის კიბო არის სარძევე ჯირკვლის კიბოს ქვეტიპი, რომელსაც აქვს სამმაგი უარყოფითი ფენოტიპი და ასოცირდება სწრაფ პროგრესირებასთან. უნდა აღინიშნოს, რომ ბაზალური კიბოს ყველა შემთხვევა ხშირად არასწორად დიაგნოზირებულია, როგორც ტრანსცხიმოვანი კიბო (TNBC), თუმცა მხოლოდ 77% არის TNBC; ამის საპირისპიროდ, TNBC-ს შემთხვევების 71–91% ბაზალურია, რაც მიუთითებს, რომ სარძევე ჯირკვლის კიბოს ეს ორი ტიპი ერთმანეთს ემთხვევა და სხვადასხვა კლასიფიკაციას წარმოადგენს (Wang D.-Y. et al., 2019). ეს ქმნის TNBC-ს ჰეტეროგენულობის დახასიათების აუცილებლობას პროგნოზის გასარკვევად და მიმდინარე და სამომავლო მკურნალობაზე პოტენციური რეაქციების დასადგენად. გარდა ამისა, TNBC სარძევე ჯირკვლის კიბოს ყველა შემთხვევის 15–20%-ს შეადგენს და უფრო ხშირია 50 წლამდე ასაკის ქალებში. BRCA1 ან BRCA2 მუტაციები TNBC შემთხვევების დაახლოებით 20%-ში დაფიქსირდა (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). კვლევებმა ასევე აჩვენა, რომ TNBC-ს აქვს განსხვავებული იმუნური მიკროგარემოსი, რომელიც მოიცავს სისხლძარღვთა ენდოთელური ზრდის ფაქტორების, სიმსივნესთან ასოცირებული მაკროფაგების (TAMs), სიმსივნეში ინფილტრირებული ლიმფოციტების (TILs) და სხვა მოლეკულების მაღალ დონეს, რომლებიც მონაწილეობენ სიმსივნის ზრდასა და მიგრაციაში. ამიტომ, TNBC-ს მიკროგარემოს გაგება კრიტიკულად მნიშვნელოვანია მისი პროგნოზისა და მკურნალობისთვის (Fan and He, 2022).
ტრანსცხიმოვანი კიბოს პროგნოზის შესაფასებლად და ეფექტური მკურნალობის უზრუნველსაყოფად მნიშვნელოვანია ზუსტი დიაგნოზი, ძირითადად იმუნოჰისტოქიმიის (IHC) საფუძველზე ER, PR და HER2-ის გამოსავლენად, და მამოგრაფია სარძევე ჯირკვლის ნეოპლაზმების გამოსავლენად. თუმცა, მამოგრაფიას არ შეუძლია ადეკვატურად ასახოს სიმსივნისშიდა მახასიათებლები, როგორიცაა ნეკროზი და ფიბროზი (Deepak Singh et al., 2021). რადგან ცუდი პროგნოზი და დიაგნოზი ხელს უშლის ექიმებს სწორი მედიკამენტების დანიშვნაში (Chaudhary, 2020), ტრანსცხიმოვანი კიბოს მქონე პაციენტების მოვლის გასაუმჯობესებლად გამოიყენება სხვადასხვა სტრატეგია. ამჟამად, ტრანსცხიმოვანი კიბოს მქონე პაციენტებში გამოიყენება ორი პრეპარატი, დოქსორუბიცინი და ციკლოფოსფამიდი, რომლებმაც კარგი შედეგები აჩვენეს. გარდა ამისა, გამოიყენება სხვა პლატინის პრეპარატები, როგორიცაა კარბოპლატინი და ცისპლატინი (Sikov et al., 2015). გარდა ამისა, ტრანსცხიმოვანი კიბოს სამკურნალოდ პოტენციურ ქიმიოთერაპიულ პრეპარატებად გამოიყენება PARP ინჰიბიტორები, როგორიცაა ოლაპარიბი, ველაპარიბი და PF-01367338 (Ishino et al., 2018). ვინაიდან Wnt/b-Catenin-ის, NOTCH-ის და Hedgehog-ის სასიგნალო გზები, როგორც ცნობილია, მონაწილეობენ ტრანსტრანსფერული კიბოს (TNBC) განვითარებასა და პროგრესირებაში, ამ გზებზე წამლების მიზანმიმართული გამოყენება შესაძლოა მნიშვნელოვანი სტრატეგია იყოს (Aysola et al., 2013). მიუხედავად იმისა, რომ ქირურგიული ჩარევა, სხივური თერაპია და ქიმიოთერაპია დღესაც TNBC-ის მკურნალობის ძირითად მეთოდებად რჩება, მნიშვნელოვანი პროგრესი იქნა მიღწეული ახალი მკურნალობის მეთოდების შემუშავებაში, მათ შორის მიზნობრივი თერაპიის, იმუნოთერაპიის, CRISPR-თან დაკავშირებული სხვადასხვა გენის რედაქტირების ინსტრუმენტების, როგორიცაა Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, პრაიმ რედაქტირება და CRISPR/Cas9-მიზნობრივი გენური თერაპია. აქ ჩვენ ყურადღებას გავამახვილებთ TNBC-ის მკურნალობაში გამოყენებულ სხვადასხვა CRISPR-თან დაკავშირებულ გენის რედაქტირების ინსტრუმენტებზე. მათ შორის, CRISPR/Cas9-მა ფართო ყურადღება მიიპყრო.
Cas9n, ასევე ცნობილი როგორც Cas9 ნიკაზა, არის Cas9 ცილის გენეტიკურად მოდიფიცირებული ვარიანტი, რომელიც მიღებულია CRISPR/Cas9 გენომის რედაქტირების სისტემიდან (Gupta et al., 2019). თავდაპირველი სახით, Cas9 ცილა შეიცავს ორ ნუკლეაზას დომენს: RuvC-ს და HNH-ს, რომელთა მთავარი ფუნქციაა დნმ-ის ორივე ჯაჭვის გახლეჩა. თუმცა, Cas9n-ში, ნუკლეაზას დომენებიდან ერთ-ერთი, HNH, გენეტიკურად მუტირებულია და ხდება არააქტიური. ამიტომ, Cas9n-ის HNH დომენი რჩება არაფუნქციური. მხოლოდ RuvC დომენი რჩება აქტიური, რაც Cas9n-ს საშუალებას აძლევს გაჭრას ან შექმნას რღვევები დნმ-ის ერთჯაჭვიან ჯაჭვებზე (Trevino and Zhang, 2014). Cas9-თან შედარებით, Cas9n-ს შეუძლია ეფექტურად შეამციროს სამიზნეზე გადახრილი ეფექტები და ზუსტად გააუმჯობესოს უჯრედების აღდგენის მექანიზმები. Cas9n-ის გამოყენება შესაძლებელია სხვადასხვა პრობლემის გადასაჭრელად, როგორიცაა რღვევების შექმნა კონკრეტულ ადგილებში ორჯაჭვიან დნმ-ში. ამ მიზნით, ორი Cas9n მოლეკულა გაერთიანდა და ერთად გამოიყენეს (Yee, 2016). შერეული შტოს კინაზა 3 (MLK3) არის მიტოგენით გააქტიურებული ცილოვანი კინაზა, რომელიც TNBC მეტასტაზირების დროს ძირითად რეგულატორს წარმოადგენს (Cronan et al., 2012).
MLK3-ს შეუძლია გაააქტიუროს მრავალი სასიგნალო გზა, რომელიც იწვევს TNBC მეტასტაზს. მაგალითად, c-Jun N-ტერმინალური კინაზას (JNK) გზა არეგულირებს უჯრედების მოძრაობას და უჯრედგარე მატრიქსის დეგრადაციას, ხოლო MLK3 ააქტიურებს JNK გზას, რითაც აძლიერებს უჯრედების მოძრაობას და ანიჭებს ინვაზიურ თვისებებს (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 ასევე არეგულირებს EMT-ს. ამისათვის ის ააქტიურებს ქვემოთ მდებარე ტრანსკრიფციის ფაქტორებს, როგორიცაა Snail, Slug და Twist. ეს ფაქტორები თრგუნავენ ეპითელური მარკერების ექსპრესიას და ხელს უწყობენ მეზენქიმური მარკერების ექსპრესიას, რაც იწვევს მეტასტაზური ფენოტიპის შეძენას (Casalino et al., 2023). დაფიქსირდა, რომ MLK3 ასრულებს როლს ECM-ის რემოდელირებაში და პროტეაზების, როგორიცაა მატრიქსული მეტალოპროტეინაზების (MMPs), აქტივაციაში, რომლებიც ანგრევს ECM-ს. ეს ხელს უწყობს სიმსივნური უჯრედების შეჭრას და გავრცელებას შორეულ ადგილებში (Katari et al., 2019). ამრიგად, წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ MLK3 მნიშვნელოვან როლს ასრულებს TNBC-ში. რატანასინჩაიმ და გალომ MLK3-ის როლის შესასწავლად TNBC მოდელები გამოიყენეს და აღმოაჩინეს, რომ ის სპეციფიკური სასიგნალო გზებით ხელს უწყობს კიბოს განვითარებას. მათ MLK3-ის რედაქტირებისთვის CRISPR/Cas9n გამოიყენეს და TNBC მეტასტაზების მნიშვნელოვანი შემცირება დააკვირდნენ (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9, რომელსაც ხშირად არააქტიურ Cas9-ს უწოდებენ, Cas9 ცილის მოდიფიცირებული წარმოებული ფორმაა. აქტიური Cas9-ისგან განსხვავებით, dCas9-ს არ გააჩნია ენდონუკლეაზური აქტივობა, რაც მას დნმ-ის ორჯაჭვიანი რღვევის ინდუცირების შეუძლებელს ხდის. ამიტომ, dCas9 შეიძლება გამოყენებულ იქნას გენომის კონკრეტული რეგიონების ზუსტად დასამიზნებლად დნმ-ის თანმიმდევრობის რაიმე ცვლილების ან მოდიფიკაციის გარეშე (Wang et al., 2016). dCas9-ში ორი ენდონუკლეაზური ცილა, RuvC და HNH, ინაქტივირდება მნიშვნელოვანი ამინომჟავური ნარჩენების დათრგუნვით (Richter et al., 2016). დნმ-ის დაშლის აქტივობის არარსებობის მიუხედავად, dCas9 ასრულებს რიგ მნიშვნელოვან როლებს გენეტიკურ კვლევასა და ბიოტექნოლოგიაში. მაგალითად, ის საშუალებას იძლევა გენომის კონკრეტული რეგიონების ვიზუალიზაციის, ტრანსკრიფციული რეგულირების და ეპიგენეტიკური მოდიფიკაციების (Brocken et al., 2018).
ტრანსკრიფციის ფაქტორი ZEB1 (თუთიის თითის E-ყუთთან შეკავშირების ჰომეობოქსი 1) ასრულებს სპეციფიკურ და კრიტიკულ როლს ეპითელურ-მეზენქიმური გარდამავალი პროცესის (EMT) შუამავლობაში, რომელიც ემბრიონის განვითარების, ქსოვილების აღდგენისა და კიბოს პროგრესირების დროს ხდება. ის გულისხმობს ეპითელური უჯრედების მეზენქიმურ უჯრედებად ტრანსფორმაციას, რაც იწვევს უჯრედების მორფოლოგიის, მოძრაობის, ინვაზიურობის და ა.შ. ცვლილებებს (Wu et al., 2020). ZEB1 თრგუნავს მრავალ ეპითელურ მარკერს, როგორიცაა E-კადერინი და ოკლუდინი, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან უჯრედშორისი ადჰეზიისა და ეპითელური უჯრედების პოლარობის შენარჩუნებაზე TNBC-ში (Moreno-Bueno et al., 2008). გარდა ამისა, ZEB1 ააქტიურებს გარკვეულ მარკერებს, როგორიცაა N-კადერინი, ვიმენტინი და ფიბრონექტინი (Konradi et al., 2014) და ასევე არეგულირებს ციტოსკელეტური რემოდელირების პროცესში ჩართულ გენებს, როგორიცაა Rho GTPაზები და მატრიქსული მეტალოპროტეინაზები (MMPs) (Huang). და სხვ., 2014). 2022), გარდა ამისა, ის ასევე მოქმედებს სხვადასხვა სასიგნალო გზებზე, როგორიცაა ტრანსფორმირებადი ზრდის ფაქტორი-β (TGF-β), Wnt სიგნალიზაცია და ა.შ., რითაც ხელს უწყობს სიმსივნის ინვაზიას და მეტასტაზირებას TNBC-ში (Chen et al., 2016). მრავალრიცხოვანი კვლევები და სამეცნიერო მტკიცებულებები მიუთითებს, რომ ZEB1-ს აქვს დიდი პოტენციალი, როგორც ღირებული აგენტი TNBC-ის გამოვლენისა და თერაპიული ჩარევისთვის. ბოლოდროინდელ კვლევაში, Waryah-მა და სხვებმა გამოიყენეს TNBC მოდელი და მიაღწიეს ZEB1-ის სრულ სუპრესიას dCas9-ით. ამრიგად, მათ დააფიქსირეს ძალიან მაღალი სპეციფიკურობა და ZEB1-ის თითქმის სრული ინჰიბირება in vivo პირობებში (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 არის გენის რედაქტირების ინსტრუმენტი, რომელსაც CRISPR/Cpf1 ეწოდება. ის წარმოებულია CRISPR/Cas სისტემიდან, სადაც ტერმინი Cas12 ეხება CRISPR-თან ასოცირებულ ცილა 12-ს (Bharathkumar et al., 2022), რომელიც სრულიად ჰგავს Cas9-ს. ერთადერთი განსხვავება ისაა, რომ ის შეიცავს Cas12 ცილას. Cas9-თან შედარებით, Cas12-ს აქვს რამდენიმე უნიკალური ფუნქცია, როგორიცაა წებოვანი ბოლოების გენერირება გენის რედაქტირების პროცესში, ხოლო Cas9 წარმოქმნის ბლაგვი ბოლოების (Wang et al., 2021). Cas12-ის ეს თვისება ხელს უწყობს მის სპეციფიკურ დნმ-ის მანიპულირების ტექნოლოგიას. როგორც ცილა, რომელსაც შეუძლია სამიზნე დნმ-ის ზუსტად ამოცნობა და დაჭრა, მას აქვს განსაკუთრებული მრავალფეროვნება, რაც მას ეფექტურ ინსტრუმენტად აქცევს სხვადასხვა გამოყენებისთვის, მათ შორის გენის რედაქტირებისთვის (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
სხვა CRISPR ვარიანტების მსგავსად, CRISPR/Cas12-ს ასევე შეუძლია TNBC-ში გენების გამორიცხვა ან გააქტიურება, რაც მიზნად ისახავს იმ გენებს, რომლებიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ მის პათოგენეზში ან მკურნალობაზე რეაგირებაში (Yang and Zhang, 2023). ამ პროცესის განსახორციელებლად შემუშავდა სახელმძღვანელო რნმ (gRNA), რომელიც Cas12-ს სამიზნე გენზე მიმართავს. მას შემდეგ, რაც Cas12 დაუკავშირდება თავის სამიზნეს, ის დნმ-ში ორჯაჭვიან რღვევებს იწვევს და ააქტიურებს დნმ-ის აღდგენის მექანიზმებს. აღდგენის პროცესის დროს შეიძლება შედიოდეს არასწორი ნუკლეოტიდები, რაც იწვევს გენის მუტაციას და ფუნქციის დაკარგვას (Zhang et al., 2021a). გარდა ამისა, გენების გასააქტიურებლად ასევე გამოყენებული იქნა Cas12 ფერმენტის გაუმჯობესებული ვერსია (dCas12). მისი ტრანსკრიფციის აქტივატორთან შერწყმით შესაძლებელია გარკვეული გენების ინდუცირება, რითაც ისინი გააქტიურდება. ამ ტექნოლოგიას დიდი პოტენციალი აქვს სიმსივნის სუპრესორული გენების აქტივაციის ხელშეწყობაში (Sultan et al., 2022).
პრაიმ რედაქტირება ახლად შემუშავებული და უკიდურესად მოწინავე გენომის რედაქტირების ტექნოლოგიაა. მას შეუძლია ორგანიზმის დნმ-ის ძალიან ზუსტად მოდიფიცირება (ჩენ და ლიუ, 2023). პრაიმ რედაქტირება მიიღწევა ორი ძირითადი კომპონენტის ინტეგრაციით: მოდიფიცირებული CRISPR/Cas9 ფერმენტი და უკუ ტრანსკრიპტაზა. CRISPR/Cas9 ფერმენტის როლი გენომში ზუსტი ადგილების შერჩევით დამიზნებაა, ხოლო უკუ ტრანსკრიპტაზა ხელს უწყობს დნმ-ის საფუძვლიან მოდიფიცირებას სამიზნე ადგილას (ჰასანი და სხვ., 2021). პრაიმერის რედაქტირების მექანიზმში პირველი ნაბიჯი მოიცავს პრაიმერის რედაქტირების სახელმძღვანელო რნმ-ის (pegRNA) შექმნას (Standage-Beier და სხვ., 2021). ის შეიცავს სამიზნე თანმიმდევრობას და რნმ-ის შაბლონს, რომელიც შეესაბამება სამიზნე დნმ-ში სასურველ რედაქტირების ადგილს. შემდეგ pegRNA შეჰყავთ სამიზნე უჯრედებში პრაიმერის რედაქტირების ნუკლეაზასთან (PE2) ერთად. PE2 არის შერწყმული ცილა, რომელიც შედგება Cas9 ფერმენტისგან, უკუ ტრანსკრიპტაზასგან და პრაიმერის რედაქტირების ადაპტერისგან (მარტინ-ალონსო და სხვ., 2021). უჯრედის შიგნით, pegRNA და PE2 კომპლექსები ეძებენ იმ სპეციფიკურ დნმ-ს, რომლის მოდიფიცირებაც სურთ. Cas9 ფერმენტი ჭრის დნმ-ს და ქმნის შაბლონს, რომელიც შედგება ერთჯაჭვიანი ძაფებისგან (Choi et al., 2022). უკუ ტრანსკრიპტაზა იყენებს ამ შაბლონს დნმ-ის რედაქტირებისთვის მოსამზადებლად. დნმ-ის კოპირებასთან ერთად, ასევე შედის რნმ-ის შაბლონის რედაქტირების ინსტრუქციები. და ბოლოს, ახლად შექმნილი დნმ-ის ჯაჭვი გამოიყენება შაბლონად დნმ-ში არსებული რღვევის აღსადგენად, რაც იწვევს შეცვლილი დნმ-ის თანმიმდევრობის წარმოქმნას, რომელიც შეიცავს სასურველ მოდიფიკაციას (Ochoa-Sanchez et al., 2021). პრაიმერის რედაქტირების მექანიზმებმა შეიძლება გამოიწვიოს გენებში ფართოდ გავრცელებული მუტაციები. მას შეუძლია მიზნად ისახავდეს წერტილოვან მუტაციებს, ჩანართებს, დელეციებს და გენების ჩანაცვლებასაც კი (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). პრაიმ რედაქტირებას რამდენიმე უპირატესობა აქვს გენომის რედაქტირების წინა ტექნოლოგიებთან შედარებით. ესენია გაზრდილი სიზუსტე, შემცირებული სამიზნე ეფექტები და დნმ-ის რედაქტირების შესაძლებლობა დნმ-ის ორჯაჭვიანი რღვევების დაყრდნობის გარეშე (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9 ტექნოლოგია თავდაპირველად შემუშავდა ბაქტერიების პლაზმიდური გადაცემისა და ფაგური ინფექციისგან დასაცავად და მოგვიანებით ხელახლა გამოიყენეს, როგორც ეფექტური რნმ-ზე დაფუძნებული დნმ-ის სამიზნე ინსტრუმენტი გენომის რედაქტირებისთვის (Jiang and Doudna, 2017). გარდა ამისა, CRISPR/Cas9 სისტემა წარმოდგენილია ბაქტერიული და არქეული გენომების შესაბამისად 50%-ში და 87%-ში (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 წარმოადგენს პოტენციურ ინსტრუმენტს ნებისმიერი პათოლოგიური გენეტიკური თანმიმდევრობის წაშლის, ჩასმისა და კორექციისთვის in vivo და in vitro რეჟიმების გამოყენებით (Sabit et al., 2021). გარდა ამისა, ნაჩვენებია, რომ CRISPR/Cas9 ადაპტური იმუნური სისტემის ნაწილია მისი სპეციფიკურობის გამო საინტერესო სამიზნე გენების მიმართ (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 შედგება Cas9-ისა და ერთი სახელმძღვანელო რნმ-ისგან (sgRNA). Cas9 არის ენდონუკლეაზა, რომელიც შედგება მრავალი ცილოვანი კომპონენტისგან. გარდა ამისა, Cas9-ს აქვს უნიკალური სტრუქტურული და კონფორმაციული თვისებები (Pacesa et al., 2022), რადგან ის შედგება ორი წილისგან: ამოცნობის (REC) და ნუკლეაზის (NUC). REC წილი ასევე იყოფა სამ რეგიონად: REC1, REC2 და ხიდისებრი სპირალები (Cromwell et al., 2018). NUC შედგება სამი წილისგან, კერძოდ RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH და პროტოსპეისერის მიმდებარე მოტივის (PAM) ურთიერთქმედების დომენი (სურ. 1) (Song et al., 2016). sgRNA შედგება ორი კომპონენტისგან, მათ შორის CRISPR რნმ (crRNA) და ტრანსკოდირების მცირე რნმ (ტრასერ რნმ) (სურათი 1). sgRNA აკავშირებს Cas9 ცილას კონექსინებთან აქტიური კომპლექსის წარმოქმნით, რომელიც ასევე ცნობილია როგორც ეფექტორული კომპლექსი (Richter et al., 2012). crRNA არის 18-20 ნუკლეოტიდის წყვილი, რომელიც მნიშვნელოვან როლს ასრულებს სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობების ამოცნობაში. გარდა ამისა, crRNA წყვილდება სამიზნე დნმ-თან და tracrRNA მოქმედებს როგორც საყრდენი Cas9 ნუკლეაზასთვის, რათა დაუკავშირდეს სამიზნე დნმ-ს (Manghwar et al., 2019). მეორეს მხრივ, PAM თანმიმდევრობას აქვს 3 ნუკლეოტიდი, რაც ადასტურებს, განსაზღვრავს და შუამავლობს ეფექტორული კომპლექსის დნმ-თან შეკავშირებას. Cas9 ცილოვანი კომპლექსის ქვეერთეულებს RuvC და HNH აქვთ კატალიზური აქტივობა (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Cas9 ქვეერთეულის HNH ნუკლეაზას დომენი არღვევს crRNA-სთან დაკავშირებულ დნმ-ის ჯაჭვს. RuvC ნუკლეაზას დომენი არღვევს დნმ-ის სხვა ჯაჭვებს და წარმოქმნის ორჯაჭვიან წყვეტებს (DSB), რის შემდეგაც აქტიურდება დნმ-ის რღვევის აღდგენის ორი განსხვავებული მექანიზმი (Jiang and Doudna, 2017) (სურათი 1).
სურათი 1. CRISPR/Cas9-ის მიმოხილვა (A). CRISPR/Cas9 სისტემის კომპონენტები: (i). Cas9 ენდონუკლეაზა პასუხისმგებელია სამიზნე დნმ-ის თანმიმდევრობის დაჭრაზე, (ii) ერთიანი სახელმძღვანელო (sg) რნმ-ზე, რომელიც წარმოიქმნება crRNA-სა და tra-crRNA-ს ქიმერების შერწყმის შედეგად. (ორი). Cas9 მოიცავს რამდენიმე კომპონენტს, როგორიცაა Rec I, Rec II, NUC წილი (HNH და Ruv C ქვეკომპონენტებია) და PAM ურთიერთქმედების დომენი (C) შესაბამისი ფუნქციებით. CRISPR/Cas9 ცილოვანი კომპლექსი ყოფს დნმ-ის თანმიმდევრობებს არაკომპეტენტურ და კომპლემენტარულ ფორმებად (D). CRISPR/Cas9 რედაქტირებს გენომს სამ ეტაპად: ამოცნობა, დაჭრა და აღდგენა. შექმნილი sg-RNA ხელმძღვანელობს Cas9-ს და ამოიცნობს სასურველ თანმიმდევრობას კომპლემენტარული კომპონენტის crRNA-ს მეშვეობით. Cas9 ამოიცნობს PAM თანმიმდევრობას 5′-NGG-3′-ზე და დნობს დნმ-ს, ქმნის დნმ-რნმ ჰიბრიდს და ააქტიურებს დაშლას. Cas9-ის HNH დომენი ხლეჩს კომპლემენტარულ ჯაჭვს, ხოლო RuvC დომენი - არაკომპეტენტურ ჯაჭვს. CRISPR/Cas9 აღადგენს dsDNA-ს მისი ორი გზით დაშლით: არაჰომოლოგიური ბოლოების შეერთებით (NHEJ) და ჰომოლოგიაზე ორიენტირებული შეკეთებით (HDR). NHEJ აღადგენს ორჯაჭვიან დნმ-ს უცხო ჰომოლოგიური დნმ-ის არარსებობის შემთხვევაში ფერმენტული პროცესის მეშვეობით, რაც შეცდომებისადმი მიდრეკილი მექანიზმია, რომელსაც შეუძლია შემთხვევითი დნმ-ის თანმიმდევრობების ჩასმა ან ამოღება. HDR ძალიან სპეციფიკურია და მოითხოვს ჰომოლოგიურ დნმ-ის შაბლონებს.
CRISPR/Cas9-ით განპირობებული აღდგენის გზები მოიცავს არაჰომოლოგიურ ბოლოების შეერთების (NHEJ) და ჰომოლოგიაზე მიმართულ აღდგენის (HDR) მექანიზმებს. NHEJ შეცდომებისკენ მიდრეკილი გზაა, რადგან ის მოიცავს ჩასმას ან წაშლას და არ საჭიროებს რაიმე ნიმუშს აღდგენის მექანიზმის დროს. ის იყენებს შემთხვევით ნუკლეოტიდებს სტანდარტული ცილების გენერირებისთვის (Abbasi et al., 2021). ეს აღდგენის სისტემა შედგება ოთხი კომპლექსისგან, როგორიცაა KU კომპლექსი, ჯვარედინი კომპლემენტაციის ცილოვანი კომპლექსი ტიპი 4 (XRCC-4), დნმ-ის ბოლოების დამუშავების ფერმენტი და ცილოვანი კინაზა DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). KU კომპლექსურ ცილას აქვს ორი ქვეერთეული, Ku 70 და Ku 80, და მნიშვნელოვან როლს ასრულებს NHEJ მექანიზმში, რადგან აღდგენის მექანიზმი იწყება ორი ქვეერთეულის (Ku 70 და Ku 80) შეკავშირებით სამიზნე დნმ-ის ბლაგვი ან თითქმის ბლაგვი ბოლოების მიმართ (Abbasi et al., 2021), რაც ემსახურება როგორც საყრდენს NHEJ-თან დაკავშირებული სხვა ფაქტორების დაზიანების ადგილზე მოსაზიდად (Yang et al., 2020). XRCC-4 და დნმ ლიგაზა შედგება შესაბამისად 334 და 911 ამინომჟავისგან, ხოლო XRCC4-დნმ ლიგაზა IV კომპლექსი ასტიმულირებს დნმ-ის ბოლოების ლიგაციას (Chatterjee et al., 2015). დნმ-ის ბოლოების დამუშავების ფერმენტი, ასევე ცნობილი როგორც პოლინუკლეოტიდ კინაზა 3′-ფოსფატი, არის დნმ-ის ბოლოების დამუშავების ფერმენტი. მას შეუძლია დნმ-ში 3′P ჯგუფის მოცილება და 5′OH ჯგუფის ფოსფორილირება DSB აღდგენის დროს. ის ასევე მოიცავს ერთჯაჭვიანი წყვეტების (SSB) აღდგენას SSB აღდგენის გზის გამოყენებით (Chatterjee et al., 2015). ცილოვანი კინაზა DNA-PKcs არის დნმ-დამოკიდებული ცილოვანი კინაზა, რომელიც შედგება PIKK-ების (ფოსფატიდილინოზიტოლ 3-კინაზასთან დაკავშირებული კინაზები) და ატაქსია-ტელანგიექტაზიის მუტირებული (ATM) ოჯახის კატალიზური ქვეერთეულისგან, ასევე ATM და Rad3-თან დაკავშირებული ATR-ებისგან, ჯაჭვის წყვეტებისგან (DSB) და ერთჯაჭვიანი წყვეტებისგან (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR უფრო ზუსტი და შესაფერისი აღდგენის მექანიზმია, რადგან ინფორმაცია კოპირდება ჰომოლოგიური დნმ-ის დუპლექსის ინტაქტური ფორმის გამოყენებით, თუმცა ეს მოითხოვს დაძმობილებული ქრომატიდების არსებობას. ეს ხდება ძუძუმწოვრების უჯრედული ციკლის S/G2 ფაზის დროს. HDR ძირითადად გვხვდება საფუარის სახეობებში, მაგრამ NHEJ კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ძუძუმწოვრებში (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). აღდგენის სრული მექანიზმი ნაჩვენებია ნახაზ 1-ში.
ვინაიდან ტრანსკრიფციული კიბოს (TNBC) გამომწვევი გენეტიკური და ეპიგენეტიკური ანომალიებია, ავთვისებიანი გენომური/ეპიგენომური ანომალიების კორექცია CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით შეიძლება იყოს გონივრული თერაპიული მიდგომა (Chen et al., 2019). გარდა ამისა, უჯრედ-სპეციფიკურ ტრანსკრიფციულ რეგულაციაში ჩართულ ზოგიერთ ტრანსკრიფციულ ფაქტორს შეიძლება ჰქონდეს კიბოს უჯრედების უნიკალური მახასიათებლები, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ტრანსკრიფციული რეგულაცია შეიძლება იყოს კიბოს მკურნალობის შესანიშნავი მიდგომა (Drost et al., 2017). სიმსივნეების ამ მოლეკულური მახასიათებლების, როგორიცაა გენეტიკური, ეპიგენეტიკური და ტრანსკრიფციული დეფექტები, გამოყენება წამლის შემუშავებისთვის შეიძლება გააუმჯობესოს კლინიკური შედეგები და შეამციროს სკრინინგის ხარჯები. CRISPR არის პოტენციური გენის რედაქტირების ინსტრუმენტი, რომელსაც შეუძლია არა მხოლოდ კიბოს გამომწვევი გენომური სამიზნეების აღმოჩენა და იდენტიფიცირება, არამედ მისი გამოყენება შესაძლებელია ადამიანის უჯრედებში ონკოგენების რედაქტირებისთვის, დათრგუნვისთვის და ეპიგენეტიკურად მოდიფიცირებისთვის (ცხრილი 1) (Ahmed et al., 2021). ჩატარდა რამდენიმე CRISPR სკრინინგი სიმსივნის სუპრესორებთან, ონკოგენებთან და წამლის მიმართ რეზისტენტობასთან დაკავშირებული გენების მოსაძებნად. CRISPR/Cas9-ის გამოყენება სხვადასხვა TNBC ონკოგენების რედაქტირებისთვის ნაჩვენებია ნახაზ 2-ში.
სურათი 2. სხვადასხვა TNBC ონკოგენების გენის რედაქტირება CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით, რაც იწვევს სიმსივნის ზრდისა და მეტასტაზირების შემცირებას. ეს ონკოგენებია CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 და CXCR7, Crypto1, ROR1 და ST8SIA, რომლებიც მონაწილეობენ TNBC-ის წარმოქმნასა და მეტასტაზირებაში.
კიბოს უჯრედების მიგრაცია, ინვაზია და ეპითელურ-მეზენქიმური ტრანზიცია (EMT) დაკავშირებულია ITGA9-თან. წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ ITGA9 Notch-ის გზაზე მთავარი მოთამაშეა და საინტერესო როლს ასრულებს რაბდომიოსარკომის მეტასტაზირებაში (Molist et al., 2020). გარდა ამისა, აღმოჩნდა, რომ ITGA9 მჭიდრო კავშირშია პაციენტის პროგნოზთან სიმსივნის რამდენიმე ტიპის შემთხვევაში, მათ შორის სარძევე ჯირკვლის კიბოს შემთხვევაში (Wang Z. et al., 2019). გარდა ამისა, ITGA9-ის ბიოინფორმატიულმა ანალიზმა აჩვენა, რომ მისი ექსპრესია TNBC-ში მნიშვნელოვნად მაღალი იყო, ვიდრე სარძევე ჯირკვლის კიბოს სხვა ქვეტიპებში. ITGA9-ის მომატებული დონე დაკავშირებულია სიმსივნის მეტასტაზირებასთან და რეციდივთან TNBC პაციენტებში. ITGA9-ის ნოკაუტი CRISPR/Cas9-ით იწვევს კიბოს ღეროვანი უჯრედების (CSC) მსგავს თვისებებს, სიმსივნის ანგიოგენეზს, სიმსივნის ზრდას და მეტასტაზების შემცირებას TNBC-ში β-კატენინის დეგრადაციის ხელშეწყობით (Wang Z. et al., 2019).
კრიპტო-1 TGF-β ოჯახის წევრია და კრიტიკულად მნიშვნელოვანია ადრეული ემბრიოგენეზის, ღეროვანი უჯრედების შენარჩუნებისა და კიბოს მეტასტაზირებისთვის (Ishii et al., 2021). ასევე ცნობილია როგორც Tdgf-1, ის არის ონკოგენური GPI-მიმაგრებული სასიგნალო ცილა, რომელიც მონაწილეობს პრიმიტიული ზოლის, მეზოდერმისა და ენდოდერმის ფორმირების რეგულირებაში, ასევე მარცხენა/მარჯვენა ასიმეტრიის ჩამოყალიბებაში სხეულის ორგანოების განვითარებაში ემბრიოგენეზის დროს (Zhang et al., 2021b). გარდა ამისა, ნაჩვენებია, რომ Cripto-1 მონაწილეობს ეპითელურ-მეზენქიმურ გარდამავალ პროცესში (EMT), როგორც ღეროვანი უჯრედების მარკერი (Zhang et al., 2021b). EMT კრიტიკულად მნიშვნელოვანია არა მხოლოდ სხვადასხვა პროცესისთვის, როგორიცაა ემბრიონის განვითარება, ფიბროზი და ჭრილობების შეხორცება, არამედ კიბოს ინვაზიისა და მეტასტაზირებისთვისაც. გარდა ამისა, ნაჩვენებია, რომ Cripto-1 ურთიერთქმედებს ოთხ Notch რეცეპტორთან და აძლიერებს მათ პოსტტრანსლაციურ მომწიფებას (Brandstadter and Maillard, 2019). ცნობილია, რომ Notch-ის სასიგნალო გზა მონაწილეობს ადამიანის სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედების შენარჩუნებაში. კვლევებმა აჩვენა, რომ CRISPR/Cas9-ით განპირობებული Crypto-1-ის ნოკაუტი თრგუნავს კიბოს ზრდას და მეტასტაზირებას. ამიტომ, Crypto-1 შეიძლება გახდეს TNBC-ის მნიშვნელოვანი თერაპიული სამიზნე (Castro et al., 2015).
XCL12 ცილა და მისი ქემოკინური რეცეპტორი CXC (CXCR4 და CXCR7) სხვადასხვა როლს ასრულებენ კიბოს უჯრედების პროლიფერაციაში, ზრდაში, მიგრაციასა და ინვაზიაში (Wu et al., 2015). ეს ქემორეცეპტორები დაკავშირებულია ტრანსცილოზური კიბოს (TNBC) განვითარებასთან მრავალი სასიგნალო გზით, როგორც in vivo, ასევე in vitro მოდელებში (Wu et al., 2015). გარდა ამისა, CXCR4-ის და CXCR7-ის აქტივაცია დაკავშირებულია მეტასტაზირებისადმი უფრო მაღალ მგრძნობელობასთან და TNBC-ის ცუდ პროგნოზთან (Karn et al., 2022). ამიტომ, CXCR4-ის და CXCR7-ის ნოკაუტი შეიძლება გახდეს ეფექტური წამლის სამიზნე გენები სარძევე ჯირკვლის კიბოს, მათ შორის TNBC-ის სამკურნალოდ. იანგის და სხვების მიერ ჩატარებულმა კვლევამ (2019) გამოიყენა CRISPR/Cas9 CXCR4 და CXCR7 გენების ერთობლივი ნოკაუტისთვის და აჩვენა, რომ TNBC-ის პროლიფერაცია, ზრდა, მიგრაცია და ინვაზია მნიშვნელოვნად იყო დათრგუნული (Yang et al., 2019).
სარძევე ჯირკვლის კიბოს ქსოვილებში დაფიქსირდა miR-3662-ის, TNBC ონკოგენის, მომატებული დონე (Yi et al., 2022). ნაჩვენებია, რომ miR-3662-ის ნოკდაუნი აფერხებს სარძევე ჯირკვლის კიბოს სიმსივნის ზრდას და მეტასტაზირებას როგორც in vivo, ასევე in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 არის Wnt/-კატენინის სიგნალიზაციის ძლიერი ინჰიბიტორი და, სავარაუდოდ, პასუხისმგებელია TNBC უჯრედების miR-3662-ით განპირობებულ ზრდაზე. ცოტა ხნის წინ, იიმ და სხვებმა აღმოაჩინეს, რომ miR-3662-HBP1 ღერძი არეგულირებს Wnt/-კატენინის სიგნალიზაციის გზას TNBC უჯრედებში (Yi et al., 2022). სიმსივნისთვის სპეციფიკური ექსპრესიის გამო, miR-3662 შეიძლება იყოს TNBC-ის პოტენციური თერაპიული სამიზნე. ამრიგად, CRISPR/Cas9-ით განპირობებული miR-3662-ის ნოკდაუნი შეიძლება იყოს შესანიშნავი მიდგომა TNBC-ის სამკურნალოდ ახალი პრეპარატების შემუშავებისთვის.
UBR5 არის 300 kDa ნუკლეოფოსფოსფოპროტეინი, რომელიც იდენტიფიცირებულია, როგორც სიმსივნის გენეზის, მეტასტაზირებისა და იმუნური პასუხის ძირითადი რეგულატორი სხვადასხვა კიბოს დროს (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). აღინიშნა, რომ UBR5 მნიშვნელოვნად არის მომატებული TNBC ნიმუშებში და ასტიმულირებს ERα ფუნქციას პროლიფერაციის ინდუცირებით მისი უბიკვიტინ ლიგაზას აქტივობის მეშვეობით (Bolt et al., 2015). პირველადი TNBC ნიმუშების მთელი ეგზომის სეკვენირების კვლევებმა ასევე აჩვენა UBR5-ის გაზრდილი ექსპრესია, რაც მიუთითებს მის როლზე TNBC-ის განვითარებაში. გარდა ამისა, CRISPR/Cas9-ით მართულმა UBR5-ის დელეციამ აჩვენა TNBC მეტასტაზირებისა და ზრდის მნიშვნელოვანი ინჰიბირება ექსპერიმენტულ თაგვის მოდელებში. გარდა ამისა, UBR5-ის ჩართვამ ველური ტიპის თაგვის მოდელში აღადგინა მისი სრული ფუნქციონირება, მაშინ როდესაც ეს ეფექტი არ დაფიქსირებულა ინაქტივირებულ მუტანტურ შტამებში (Liao et al., 2017). UBR5-ის ნაკლებობა დაკავშირებულია ზრდილ აპოპტოზთან, ნეკროზთან და სიმსივნის ზრდის ინჰიბირებასთან ტრანსკრიფციულ კინაზას რნმ-ში ანგიოგენეზის დარღვევის გამო. UBR5-ის დაკარგვის გამო, სიმსივნის გავრცელება შორეულ ორგანოებზე მცირდება და UBR5 იწვევს პათოლოგიურ EMT-ს, ძირითადად E-კადჰერინის ექსპრესიის შემცირებით (Zhang and Weinberg, 2018). ცოტა ხნის წინ, UBR5 აღმოჩნდა ძალიან მნიშვნელოვანი ფაქტორი IFN-γ-ით ინდუცირებულ PDL1 ტრანსკრიფციაში ტრანსკრიფციულ კინაზას რნმ-ში, E3 უბიკვიტინაციის აქტივობის არარსებობის გამო. რნმ ტრანსკრიპტომის ანალიზმა აჩვენა, რომ UBR5-ს შეიძლება ჰქონდეს სისტემური ეფექტები IFN-γ გზასთან დაკავშირებულ გენებზე და ხელი შეუწყოს PDL1 ტრანსაქტივაციას ცილის კინაზას რნმ-ის (PKR) და მისი სიგნალის გადამყვანებისა და აქტივატორების დონის გაზრდით, ტრანსკრიფცია 1 (STAT1) და ინტერფერონის მარეგულირებელი ფაქტორი 1 (IRF1). თუმცა, UBR5-ისა და PD-L1 ექსპრესიის CRISPR/Cas9-ით განპირობებულ კომბინირებულ აბლაციას უფრო სინერგიული თერაპიული ეფექტი აქვს, ვიდრე თითოეული ცალკეული ბლოკადა, რაც სიმსივნის მიკროგარემოზე ღრმა გავლენას ახდენს (Wu et al., 2022). ამრიგად, CRISPR/Cas9 შეიძლება იყოს მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი UBR5 ფუნქციის დასათრგუნად, რითაც თრგუნავს TNBC მეტასტაზს და სიმსივნის ზრდას.
ROR1 არის I ტიპის ტრანსმემბრანული ცილა, რომელიც ექსპრესირდება კიბოს და ემბრიონის განვითარების დროს და იდენტიფიცირებულია, როგორც ონკოფეტალური ცილა (ნიკოლას ბორჩერდინგი, 2014). ადამიანის სხვადასხვა კიბოს ინვაზიური ქცევა დაკავშირებულია ROR1-ის აქტივაციასთან. იმედისმომცემი შედეგები მიღებულია in vivo და in vitro კვლევებიდან, რომლებიც მოიცავდა ROR1-ზე ორიენტირებულ თერაპიულ ნაერთებს (Chien et al., 2016). სარძევე ჯირკვლის ქსოვილის ბიოფსიებში ROR1 mRNA-ს მომატებული დონე ასევე დაკავშირებულია აგრესიულ ბაზალური მსგავსი სარძევე ჯირკვლის (BL) სიმსივნეებთან და მათ მიგრაციასთან სხეულის სხვა ნაწილებში. გარდა ამისა, ROR1-ის ჭარბი ექსპრესია იდენტიფიცირებულია, როგორც TNBC-ის განვითარების პროგნოზული მარკერები (Chien et al., 2016). თუმცა, ROR1-ის გაჩუმება CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით TNBC-ის ზრდისა და მეტასტაზების დათრგუნვის მიზნით ეფექტური სტრატეგია იქნებოდა.
სიალირების პროცესი გულისხმობს სიალის მჟავას დამატებას გლიკოკონიუგატებზე, რაც კატალიზირებულია სიალილტრანსფერაზებით (STs). ST8SIA1 მიეკუთვნება ST ოჯახს და მნიშვნელოვან როლს ასრულებს სხვადასხვა დაავადების, როგორიცაა ლიმფოციტური ლეიკემია და მსხვილი ნაწლავის კიბო, პათოგენეზში (ჩანგი და სხვ., 2018). რნმ-ის თანმიმდევრობის ანალიზი აჩვენებს, რომ ST8SIA1 მაღალ დონეზეა გამოხატული ტრანსცეფციული კიბოს მქონე პაციენტების სარძევე ჯირკვლის ქსოვილში და დადებითად კორელაციაშია სიმსივნის სუპრესორული გენის p53 მუტაციებთან, რამაც შეიძლება წვლილი შეიტანოს ტრანსცეფციული კიბოს პათოგენეზში (ბატულა და სხვ., 2017). გარდა ამისა, ST8SIA1 მონაწილეობს ტრანსცეფციული კიბოს მეტასტაზირებასა და რეციდივში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ის მნიშვნელოვან როლს ასრულებს ტრანსცეფციული კიბოს წარმოქმნასა და განვითარებაში. ტრანსცეფციული კიბოს in vitro მოდელში, CRIPSR/Cas9-ით ST8SIA1-ის ნოკდაუნი ბლოკავს ზრდას და მეტასტაზირებას (ბატულა და სხვ., 2017). ეს იმაზე მიუთითებს, რომ CRISPR/Cas9 შეიძლება იყოს მნიშვნელოვანი ინსტრუმენტი TNBC-ის მკურნალობაში ST8SIA1 ონკოგენის ფუნქციის ინჰიბირებისთვის.
NAT1 არის მეტაბოლური ფერმენტი, რომელიც აკატალიზებს II ფაზის ქსენობიოტიკური ნაერთების წარმოქმნას და ექსპრესირდება ადამიანის თითქმის ყველა ქსოვილში. NAT1-ს შეუძლია გამოიყენოს კოფაქტორი ფოლატი აცეტილ-CoA-ს (აცეტილ-CoA) სამიზნედ, არომატული ამინის სუბსტრატის არარსებობის შემთხვევაშიც კი (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). კვლევებმა აჩვენა, რომ NAT1 არეგულირებს მატრიქს მეტალოპროტეინაზა 9-ის (MMP9) ფუნქციას სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედების მოდელებში და იცავს რეაქტიული ჟანგბადის სახეობებისგან (ROS) გლუკოზის შიმშილის დროს (Wang et al., 2018). ნაჩვენებია, რომ NAT1-ის დელეცია თრგუნავს პირუვატდეჰიდროგენაზას კომპლექსს, რაც იწვევს მიტოქონდრიულ დისფუნქციას (Wang L. et al., 2019). გარდა ამისა, სხვადასხვა ანგარიშებმა აჩვენა, რომ NAT1-ის ინჰიბირება მცირე მოლეკულების და siRNA-ს ჩახშობის გამოყენებით შეიძლება შეამციროს სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედების ინვაზიურობა და პროლიფერაცია (Stepp et al., 2018). ცოტა ხნის წინ, CRISPR/Cas9 გამოიყენეს NAT1-ის დასათრგუნად სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედულ ხაზში MDA-MB-231, რაც გავლენას ახდენს უჯრედულ მეტაბოლიზმზე მისი ექსპრესიის დონის მიხედვით. ამ კვლევამ ასევე აჩვენა, რომ NAT-1 კრიტიკულია TNBC-ის პროგრესირებისა და მეტასტაზირებისთვის (Carlisle et al., 2020).
ონკოგენების კოორდინირებული ტრანსკრიფცია რეგულირდება სუპერენჰანსერებით, ტრანსკრიფციის ფაქტორებითა და კოფაქტორებით (Hnisz et al., 2015). გარდა ამისა, ტრანსკრიფციის რეგულაციისთვის აუცილებელია ციკლინ-დამოკიდებული კინაზების (CDK) ჯგუფი, როგორიცაა CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 და CDK13. მათ შორის, CDK7 მონაწილეობს რნმ პოლიმერაზა II-ის ფოსფორილირებაში, რაც ძალიან მნიშვნელოვანია ონკოგენური ტრანსკრიფციის დაწყებისა და გაფართოებისთვის TNBC-ის პათოგენეზში. ერთ-ერთ მნიშვნელოვან კვლევაში, CDK7-ის დელეციამ CRISPR/Cas9-ით დათრგუნა TNBC, რაც მიუთითებს, რომ TNBC-ის პათოგენეზი CDK7-ზეა დამოკიდებული (Wang Y. et al., 2015).
კვლევებმა აჩვენა, რომ MYC-სა და RBP-ში (რნმ-შემაკავშირებელი ცილა) მუტაციები შეიძლება აპოპტოზს იწვევდეს, მაშინ როდესაც MYC-ში ან RBP-ში ცალკეული გენის მუტაციები გავლენას არ ახდენს კიბოს უჯრედების ზრდაზე (Einstein et al., 2021). ადამიანის გენომში 1000-ზე მეტი RBP იქნა სკრინირებული CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებული ბიბლიოთეკის გამოყენებით. მათ შორის, 57 RBP აღმოჩნდა კრიტიკული სიმსივნური უჯრედების ზრდისთვის, რომლებსაც აქვთ MYC-ის მაღალი დონე (Wheeler et al., 2020). გარდა ამისა, YTHDF2 მნიშვნელოვანია TNBC უჯრედების ზრდის შესანარჩუნებლად და ამცირებს მეთილირებული ტრანსკრიპტების რაოდენობას მაღალი დონის ტრანსკრიფციისა და ტრანსლაციის დროს კიბოს უჯრედებში, რომლებსაც აქვთ MYC-ის მაღალი ექსპრესია. გარდა ამისა, YTHDF2 არ არის აუცილებელი კიბოს უჯრედებისთვის, რომლებიც ნაკლებად არიან დამოკიდებულნი MYC-ის მომატებულ დონეზე TNBC პაციენტების გადარჩენის გასახანგრძლივებლად (Einstein et al., 2021), რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ის შეიძლება იყოს პოტენციური თერაპიული სამიზნე იმ პრეპარატებისთვის, რომლებსაც შეუძლიათ TNBC-ის დაძლევა.
თუთიის თითის ცილები (ZNF) ადამიანის გენომის დაახლოებით 1%-ს შეადგენს. კვლევებმა აჩვენა, რომ ZNF-ს შეუძლია უჯრედების პროლიფერაციის რეგულირება სხვადასხვა კიბოს დროს, როგორიცაა ღვიძლის კიბო, სარძევე ჯირკვლის კიბო და მსხვილი ნაწლავის კიბო (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). CRISPR ნოკაუტით გენერირებული ბიბლიოთეკები გამოიყენება სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედებში სხვადასხვა სიმსივნის სუპრესორი გენების (TSG) სკრინინგისთვის (Shalem et al., 2014). მას შემდეგ, CRISPR/Cas9 ZNF319-ით წაშლილი სარძევე ჯირკვლის კიბოს უჯრედების ტრანსკრიპტომიულმა კვლევამ აჩვენა, რომ ZNF319 არის სიმსივნის სუპრესორი გენი, რომელიც ამცირებს სარძევე ჯირკვლის კიბოს პროლიფერაციას და შესაბამისად, მონაწილეობს სხვადასხვა პოტენციურ სასიგნალო მექანიზმებსა და სხვა ბიოლოგიურ ფუნქციებში (Wang L. et al., 2022).
ფეროპტოზი დაპროგრამებული უჯრედული სიკვდილის სახეობაა, რომელიც რკინის არსებობაზეა დამოკიდებული. ცნობილია, რომ ფეროპტოზის განვითარებაზე გავლენას ახდენს ლიპიდური პეროქსიდების არსებობა. გარდა ამისა, PKCβII-ში აღინიშნება ლიპიდების ადრეული პეროქსიდაცია, ხოლო ლიპიდების პეროქსიდაციის გაზრდა დაკავშირებულია ფეროპტოზთან. CRISPR/Cas9-ით განპირობებული კინაზას ინჰიბიტორების ბიბლიოთეკის სკრინინგმა აჩვენა, რომ PKCβII მონაწილეობს ლიპიდების პეროქსიდაციის პროცესში, რაც კრიტიკულია ფეროპტოზისთვის MDA-MB-231 უჯრედებში (Zhang et al., 2022). ამრიგად, ეს იმაზე მიუთითებს, რომ PKCβII-ის CRISPR/Cas9-ით ნოკაუტი შეიძლება იყოს სიმსივნის სუპრესორული გენის პოტენციური სამიზნე ფეროპტოზთან დაკავშირებული დაავადებების სამკურნალოდ (Zhang et al., 2022).
ითვლება, რომ წამლის მიმართ რეზისტენტობა პასუხისმგებელია კიბოთი დაავადებულ პაციენტებში სიკვდილიანობის დაახლოებით 90%-ზე და წარმოადგენს კიბოს მკურნალობის ერთ-ერთ მთავარ გამოწვევას (Bukowski et al., 2020). შედეგები მიუთითებს, რომ წამლის გამოდევნასთან, დნმ-ის აღდგენასთან, აპოპტოზთან და სხვადასხვა უჯრედული სიგნალიზაციის გზებთან დაკავშირებული გენების საკმარისი რაოდენობა ასოცირდება წამლის მიმართ რეზისტენტობასთან (Haider et al., 2020). მათ შორის, CRISPR/Cas9 ინსტრუმენტებით სამიზნედ იქნა გამოყენებული რამდენიმე გენი, რომლებმაც აჩვენეს იმედისმომცემი შედეგები წამლის მიმართ რეზისტენტობის შემცირებისა და კიბოს საწინააღმდეგო მკურნალობის ეფექტურობის გაზრდის კუთხით (Vaghari-Tabari et al., 2022). გარდა ამისა, მაღალი გამტარუნარიანობის CRISPR/Cas9 გენის ნოკაუტის სკრინინგის ბიბლიოთეკები დაკავშირებულია წამლის მიმართ რეზისტენტობის პოტენციური გენის სამიზნეების ფუნქციის მოდიფიცირებასთან (Shalem et al., 2015). პაკლიტაქსელის მიმართ რეზისტენტობის გენების იდენტიფიცირებისთვის, რვა კანდიდატი გენის იდენტიფიცირებისთვის, მათ შორის ჰისტონდეაცეტილაზა 9-ის (HDAC9) გენის, რომლებიც დაკავშირებულია წამლის მიმართ რეზისტენტობასთან მორეციდივე TNBC-ის მქონე პაციენტებში (B et al., 2020). სხვა კვლევაში, TNBC-ით დაავადებული პაციენტების გადარჩენის პერიოდში, რომლებიც მკურნალობდნენ კიბოს საწინააღმდეგო პრეპარატებით, დაფიქსირდა დისერინ/თრეონინის და ტიროზინ პროტეინ კინაზას (DSTYK) გაზრდილი ექსპრესია. გარდა ამისა, CRISPR/Cas9-ით განპირობებულმა DSTYK-ის ნოკდაუნმა მნიშვნელოვნად გააძლიერა წამლის მიმართ რეზისტენტული კიბოს უჯრედების აპოპტოზი in vitro (SUM102PT უჯრედები და MDA-MB-468 უჯრედები) და in vivo TNBC მოდელში (Ogbu et al., 2021).
მიუხედავად იმისა, რომ TNBC-ს MAPK გზის პათოლოგიური აქტივაცია აქვს, MEK-მიზნობრივი თერაპიის კლინიკური ეფექტი სუსტია. CRISPR/Cas9 გენომური ბიბლიოთეკის სკრინინგმა აჩვენა, რომ PSMG2-ის (პროტეომის ასამბლეის შაპერონი 2) ინჰიბირება TNBC BT549 და MB468 უჯრედებს MEK ინჰიბიტორის AZD6244-ის მიმართ სენსიბილიზაციას ახდენს. PSMG2-ის CRISPR/Cas9-ით ნოკდაუნმა შეცვალა პროტეაზომის ნორმალური ფუნქცია, რამაც გამოიწვია PDPK1-ის აუტოფაგიით განპირობებული დაშლა, რითაც კიდევ უფრო გააუმჯობესა სიმსივნური უჯრედები TNBC თაგვის მოდელებში, რომლებიც ინდუცირებული იყო AZD6244-ით (MEK ინჰიბიტორი) და MG132-ით (პროტეაზომის ინჰიბიტორი). ამრიგად, პროტეაზომის და MAP კინაზას (MEK) ინჰიბიტორების სინერგიულად მიღება შესაძლებელია სიმსივნური უჯრედების პროლიფერაციის შესამცირებლად (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 ასევე გამოყენებული იქნა TNBC-ის რეზისტენტობის გამომწვევი გენის ფუნქციის დაკარგვის სკრინინგისთვის (Shu et al., 2020). Ge-მ და სხვებმა ახსნეს JQ1-ით, BET ბრომოდომაინის ინჰიბიტორით (BBDI) დამუშავებული კიბოს უჯრედების წამლის მიმართ რეზისტენტობის მექანიზმი TNBC-ის დროს. CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით მათ აღმოაჩინეს, რომ rb1 გენის წაშლა იწვევდა TNBC-ის რეზისტენტობას კიბოს საწინააღმდეგო პრეპარატის JQ1-ის მიმართ. ამიტომ, rb1 ფუნქცია მნიშვნელოვანია JQ1 პრეპარატების მიმართ რეაქციაში TNBC-ის დროს. მათ ასევე განაცხადეს, რომ პაკლიტაქსელი არის CDK4/6 კინაზას/მიკროტუბულის ინჰიბიტორი და მისი კომბინაცია BBDI-ებთან, როგორიცაა JQ1, შეიძლება უზრუნველყოფდეს წამლის მიმართ რეზისტენტულ TNBC-ის მიმართ პერსპექტიულ თერაპიულ პასუხებს (Ge et al., 2020).
გრძელი არაკოდირებული რნმ-ის (lncRNA) ტრანსკრიფციული ლანდშაფტი, როგორც აღნიშნულია, პასუხისმგებელია ტრანსცხიმული კიბოს დროს ნეოადიუვანტური თერაპიის მიმართ რეზისტენტობაზე. ეს კვლევა აჩვენებს, რომ TNBC-ში მაღალი ექსპრესიით ხასიათდება MALAT1-ის ხუთი განსხვავებული lncRNA ტრანსკრიპტი. გარდა ამისა, CRISPR/Cas9-ით განპირობებულმა MALAT1-ის დელეციამ გაზარდა TNBC BT-549 უჯრედების მგრძნობელობა პაკლიტაქსელისა და დოქსორუბიცინის მიმართ, რაც მიუთითებს MALAT1-ის მიმართ რეზისტენტობის პოტენციურ როლზე TNBC-ში (Shaath et al., 2021).
BRCA1-ში (BRCA1m) მუტაციები ჰეტეროგენულია და შესაბამისად, მათი აღმოჩენა რთულია. BRCA1-ის სინთეზური ლეტალური პარტნიორის, PARP1-ის (პოლი(ADP-რიბოზა) პოლიმერაზას) დამიზნებამ შესაძლოა გაზარდოს TNBC-ის წამლის ქიმიომგრძნობელობა. CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით, PARP1-ის დელეციამ გაზარდა სიმსივნის საწინააღმდეგო პრეპარატების, როგორიცაა დოქსორუბიცინი, გემციტაბინი და დოცეტაქსელი, მგრძნობელობა mBRCA1 მუტანტური TNBC უჯრედების მიმართ, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ PARP1 ასევე მონაწილეობს TNBC-ის წამლისმიერი რეზისტენტობის განვითარებაში (Vaghari-Tabari et al., 2022). ცნობილია, რომ სიმსივნის სუპრესორული გენების, BRCA1 ან BRCA2 მუტაციები ზრდის ადამიანებში სარძევე ჯირკვლის კიბოს განვითარების ალბათობას. ამ პაციენტების მკურნალობა მოითხოვს PARP ინჰიბიტორების გამოყენებას. გარდა ამისა, დადასტურდა, რომ ნუკლეოტიდის სამაშველო ფაქტორის DNPH1 ნოკაუტის გამოყენება CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით აშორებს ტოქსიკურ ნუკლეოტიდ 5-ჰიდროქსიმეთილდეოქსიურიდინის (hmdU) მონოფოსფატს, რითაც აძლიერებს BRCA-დეფიციტური უჯრედების რეაქციას PARP ინჰიბიტორების მიმართ მგრძნობელობაზე (Fugger). et al., 2021). ამრიგად, CRISPR/Cas9 და PARP1 ინჰიბიტორები შეიძლება გახდეს ტრანსკრიპტოალერგიული კიბოს მკურნალობის მნიშვნელოვანი სტრატეგია.
შეღწევადი გლიკოპროტეინის (P-gp) გენი წარმოადგენს მრავალწამლისმიერი რეზისტენტობის გენს, რომელიც ზოგადად მომატებულია ტრანსცხიმოვანი კიბოს შემთხვევების დაახლოებით 41%-ში (Sun et al., 2020). P-gp-ით გამოწვეული წამლის გამოყოფა იდენტიფიცირებულია, როგორც სარძევე ჯირკვლის კიბოს დროს წამლისმიერი რეზისტენტობის ძირითადი რეგულატორი. P-gp ინჰიბიტორებმა აჩვენეს მომატებული მგრძნობელობა სარძევე ჯირკვლის კიბოს საწინააღმდეგო პრეპარატების მიმართ (Famta et al., 2021). ამრიგად, CRISPR/Cas9-ით განპირობებული აბლაცია ან P-gp-ის და P-gp ინჰიბიტორების სუპრესია შეიძლება იყოს ძალიან მნიშვნელოვანი მეთოდი ტრანსცხიმოვანი კიბოს დროს წამლისმიერი რეზისტენტობის დასაძლევად.
ცნობილია, რომ ატფ-შემაკავშირებელი კასეტური ტრანსპორტიორი G2 (ABCG2) იწვევს წამლისმიერი რეზისტენტობას ტრანსცილოზური კიბოს დროს (Palasuberniam et al., 2015), თუმცა ამჟამად არ არსებობს ცნობები CRISPR/Cas9-სა და ABCG2-ის ჩახშობასა და სიმსივნის სუპრესორული გენის ინაქტივაციას შორის კავშირის შესახებ. PTEN-მა შეიძლება გააძლიეროს ABCG2 აქტივაცია (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). ამიტომ, CRISP/Ca9-ის გამოყენება ABCG2-ის მოსაშორებლად და მისი ABCG2 ინჰიბიტორთან შერწყმა შეიძლება იყოს შესაფერისი მკურნალობა ტრანსცილოზური კიბოს დროს წამლისმიერი რეზისტენტობის დასაძლევად. ცხრილი 2-ში მოხსენიებულია CRISPR/Cas9, რომელიც მიზნად ისახავს ყველა რეზისტენტობის გენს.
ცხრილი 2. CRISPR/Cas9 მიზნად ისახავს TNBC-ის სხვადასხვა რეზისტენტობის გენს, რათა უჯრედები სიმსივნის საწინააღმდეგო პრეპარატების მიმართ სენსიბილიზაცია მოახდინოს.
CRISPR/Cas9 ბიბლიოთეკები პოტენციური ინსტრუმენტებია კიბოს პათოგენეზთან დაკავშირებული გენის მუტაციების სკრინინგისთვის (Chan et al., 2022). სკრინინგის ეს მეთოდი მოიცავს ოთხ ეტაპს, როგორიცაა (ა) ბიბლიოთეკის შექმნა, (ბ) ლენტივირუსული ტრანსდუქცია, (გ) ფენოტიპური სკრინინგი და (დ) სამიზნე გენის ანალიზი. მიუხედავად იმისა, რომ TNBC-ს აქვს MAPK გზის პათოლოგიური აქტივაცია, MEK მიზნობრივი თერაპიის კლინიკური პროგნოზი TNBC პაციენტებისთვის, რომლებიც ატარებენ სიმსივნის სუპრესორულ გენებში, როგორიცაა PTEN, RB1 და TP53, მუტაციების მატარებლები, ძალიან ცუდია.
გარდა ამისა, CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით გენის ნოკაუტის სკრინინგმა გამოსცადა ყველაზე ძლიერი და შერჩევითი მოლეკულა, დეჰიდროკატროლი, რომელიც უხვადაა გვატემალას ყვავილებისა და ფოთლების ექსტრაქტებში, რათა გაგებულიყო დეჰიდროკატროლის გავლენა MDA-MB-231-ზე. უჯრედული ციტოტოქსიურობის შერჩევითი მექანიზმები. TNBC ქვეტიპების მეზენქიმური ღეროს მახასიათებლები. CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებულმა ამ სკრინინგმა ასევე აჩვენა, რომ HSD17B11, გენი, რომელიც აკოდირებს 17β-ჰიდროქსისტეროიდ დეჰიდროგენაზას ტიპ 11-ს, მაღალ დონეზეა გამოხატული MDA-MB-231 უჯრედებში და იწვევს დეჰიდროფალკარინოლის წარმოქმნას, რომელიც სპეციფიკურია MDA-MB-231 უჯრედებისთვის (გრანტი და სხვ., 2020). ამრიგად, ეს იმაზე მიუთითებს, რომ CRISPR/Cas9 გენომურ სკრინინგს დიდი პოტენციალი აქვს პოტენციური ბუნებრივი ნაერთების კიბოს საწინააღმდეგო თვისებების საფუძვლად მყოფი მექანიზმების იდენტიფიცირებაში.
გარდა ამისა, TNBC-ის კიბოს მიმართ მოწყვლადობა შესწავლილი იქნა მიუკერძოებელი in vivo გენომის მასშტაბით CRISPR/Cas9 სკრინინგის გამოყენებით, რომელმაც აჩვენა კავშირი ონკოგენურ და სიმსივნის სუპრესორულ გზებს შორის. mTOR და Hippo გზების ძირითადი კომპონენტები, როგორც აღნიშნულია, მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ TNBC-ის სიმსივნის რეგულაციაში. გარდა ამისა, კვლევებმა აჩვენა, რომ mTORC1/2 და YAP ონკოპროტეინის ფარმაკოლოგიური ინჰიბირება ეფექტურად აფერხებს TNBC-ის პათოგენურობას in vitro წამლის მატრიცის სინერგიის მოდელის და in vivo პაციენტისგან მიღებული ქსენოტრანსპლანტატების გამოყენებით. გარდა ამისა, Torin-1-ით განპირობებული mTORC1/2 ინჰიბირება აძლიერებს მაკროპინოციტოზს, მაშინ როდესაც ვერტეპორფინით ინდუცირებული YAP ინჰიბირება იწვევს TNBC უჯრედების სიკვდილს. ერთად აღებული, ეს შედეგები ხაზს უსვამს გენომის მასშტაბით in vivo CRISPR სკრინინგის ძალასა და სიმტკიცეს TNBC-ის ახალი და ეფექტური მკურნალობის მეთოდების იდენტიფიცირებისთვის (Dai et al., 2021).
იმუნური სისტემის დისრეგულაცია სიმსივნის გენეზის მნიშვნელოვანი ფაქტორია. კიბოს უჯრედები იმუნური სისტემის გაწმენდას ერიდებიან თავდაცვის მექანიზმების გვერდის ავლით, მათ შორის სიმსივნის მიკროგარემოში იმუნური უჯრედების აქტივობაში ჩარევისა და იმუნური სისტემის დარღვევის გამო. ამიტომ, გაუმჯობესებული იმუნური სისტემის განვითარება შეიძლება სიმსივნეებთან ბრძოლის მთავარი მიდგომა იყოს. CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებული გენის მოდიფიკაციის გამოყენება იმუნური დისფუნქციასთან დაკავშირებულ რამდენიმე საკითხს სხვადასხვა პერსპექტივიდან განიხილავს. CRISPR/Cas9 გამოიყენება სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნიტეტის გასაუმჯობესებლად ძუძუს კიბოს წინააღმდეგ შემდეგი გზებით (სურათი 3).
სურათი 3. CRISPR/Cas9 იმუნოთერაპია მიმართულია TNBC უჯრედებისკენ. CDK5-ის დაკარგვა და PDL1-ისა და CD155-ის ნოკდაუნი აძლიერებს იმუნურ სისტემას. ანალოგიურად, A2AR-ის დაკარგვა და TAA-ების, როგორიცაა HER2, მუცინ 1 და TEM8, ნოკდაუნი ზრდის CAR-T უჯრედების ეფექტურობას კიბოს უჯრედების განადგურებაში. CRISPR/Cas9-ით მართულმა T უჯრედების სკრინინგმა აჩვენა, რომ p38 კინაზას დარღვევა აძლიერებს T უჯრედების სიმსივნის საწინააღმდეგო აქტივობას. CRISPR/Cas9-ით მოდიფიცირებული T უჯრედები ზრდიან TCR-ის (T უჯრედის რეცეპტორის) ექსპრესიას, რაც იწვევს T უჯრედების სიმსივნის საწინააღმდეგო აქტივობას.
იმუნოთერაპიის მიზანია იმუნური სისტემის სტიმულირება, რათა მან შეუტიოს კიბოს უჯრედებს. იმუნური საკონტროლო პუნქტის ცილების ჭარბი ექსპრესია, როგორც წესი, ხელს უშლის აუტოიმუნურ რეაქციებს, მაგრამ შეიძლება დაეხმაროს კიბოს მათ თავიდან აცილებაში (Topalian et al., 2015). ეს ცილები ხელს უშლიან იმუნურ რეაქციებს იმუნური უჯრედების ზედაპირზე არსებულ რეცეპტორებთან შეკავშირებით. მრავალი საკონტროლო პუნქტის ცილა (როგორიცაა CD155 და PD-L1) მიზნად ისახავს PD-1 რეცეპტორს იმუნურ უჯრედებზე და ექსპრესირდება სარძევე ჯირკვლის კიბოში, განსაკუთრებით ტრანსცხიმულ კიბოში (TNBC) (Li Y.-C. et al., 2020). PD-L1-ის ან მისი რეცეპტორის ნოკდაუნი CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით შეიძლება სტიმულირება გაუწიოს იმუნურ სისტემას, რათა შეუტიოს TNBC სიმსივნეებს (Yahata et al., 2019). გარდა ამისა, PD-L1 ექსპრესიის დაქვეითება CRISPR/Cas9-ით შუამავლობით CDK5-ის წაშლის გზით, როგორც ნაჩვენებია, აფერხებს სიმსივნის ზრდას in vitro და in vivo (Deng et al., 2020). სარძევე ჯირკვლის კიბოს in vitro და in vivo მოდელებში ზრდის ინჰიბირება მიუთითებს, რომ shRNA-ით განპირობებულ CD155-ის შემცირებას შესაძლოა თერაპიული ეფექტი ჰქონდეს სარძევე ჯირკვლის კიბოს წინააღმდეგ (Gao et al., 2018).
CAR T უჯრედები გამოხატავენ სიმსივნესთან ასოცირებულ ანტიგენებს (TAA) და შეუძლიათ გამოიყენონ საკონტროლო პუნქტის ცილების ნოკდაუნი მათი აქტივობის გასაძლიერებლად (Li C. et al., 2020). სარძევე ჯირკვლის კიბოს დროს CAR T უჯრედების თერაპიის სხვადასხვა პოტენციური სამიზნე არსებობს, მათ შორის რამდენიმე TAA, როგორიცაა HER2, mucin1 და TEM8 (Bajgain et al., 2018). არსებობს მტკიცებულება, რომ მეზოთელინის (ჭარბად გამოხატული TNBC BT-459 უჯრედებში) სამიზნე CAR T უჯრედები უფრო ეფექტურია კიბოს წინააღმდეგ, როდესაც PD-1 გამორიცხულია CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით (Hu et al., 2019). თუმცა, პაციენტებისგან T უჯრედების იზოლირება და შემდეგ მათი ex vivo რედაქტირება შრომატევადი და დროის მომთხოვნი პროცესია. მიუხედავად იმისა, რომ უნივერსალურ T უჯრედებს შეუძლიათ შეამცირონ იზოლაციის მოთხოვნები, დონორის T უჯრედები, რომლებიც გამოხატავენ ადამიანის ლეიკოციტების ანტიგენს (HLA) I კლასის და T უჯრედების რეცეპტორს (TCR), უნდა მოიხსნას ტრანსპლანტატისა და მასპინძლის ანომალიების თავიდან ასაცილებლად (Ren et al., 2017). , 2017a). CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით, HDR-ს შეუძლია ერთდროულად აღმოფხვრას TCR და HLA და გამორიცხოს CAR-ის კოდირების გენი. კვლევებმა აჩვენა, რომ CRISPR/Cas9 შეიძლება გამოყენებულ იქნას CD19-ის საწინააღმდეგო CAR-ების TCR ლოკუსში შესაყვანად, რითაც ეფექტურად წარმოიქმნება CAR-ები T უჯრედების შემცირების გარეშე (Dimitri et al., 2022). შემუშავებულია მულტიპლექსური ტექნოლოგიები ალოგენური CAR T უჯრედების გენერირებისთვის TCR-ის, ბეტა-2-მიკროგლობულინის (B2M), HLA-I ქვეერთეულის და სხვა ცილების, როგორიცაა PD-1 და CTLA-4, ერთდროულად აღმოფხვრით, რომლებსაც შეიძლება ჰქონდეთ უფრო ძლიერი კიბოს საწინააღმდეგო თვისებები TNBC-ის წინააღმდეგ (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
CRISPR/Cas9-ის გამოყენებამ შეიძლება გააუმჯობესოს CAR-T უჯრედების ეფექტურობა. ცნობილია, რომ ადენოზინს აქვს იმუნოსუპრესიული თვისებები და შეუძლია შეამციროს სიმსივნის საწინააღმდეგო იმუნიტეტი T უჯრედების ფუნქციის ბლოკირებით და ადენოზინის A2A რეცეპტორების (A2AR) გააქტიურებით (Vigano et al., 2019). A2AR-ის ჩახშობამ CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა CAR-T უჯრედების ეფექტურობა in vivo (Giuffrida et al., 2021). ცნობილია, რომ T უჯრედები ავლენენ სხვადასხვა ფენოტიპურ მახასიათებლებს, როგორიცაა უჯრედების გაფართოება, დიფერენციაცია, ჟანგვითი სტრესი და გენომური სტრესი. CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებულმა T უჯრედების სკრინინგმა გამოავლინა 25 სხვადასხვა T უჯრედების რეცეპტორული კინაზას დარღვევა. მათ შორის, p38 კინაზას წაშლა აძლიერებს T უჯრედების სიმსივნის საწინააღმდეგო აქტივობას, რაც მიუთითებს, რომ p38 კინაზა არის CAR-T უჯრედების რეგულირების მთავარი რეგულატორი (Gurusamy et al., 2020).
T უჯრედების გენეტიკურად მოდიფიცირება შესაძლებელია CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით მაღალი ექსპრესიის მქონე TCR-ების წარმოსაქმნელად. გენეტიკურად მოდიფიცირებული T უჯრედების პაციენტებისთვის გადაცემამ აჩვენა უფრო ძლიერი კიბოს საწინააღმდეგო აქტივობა, ვიდრე ენდოგენურ T უჯრედებს. ამიტომ, ენდოგენურმა TCR-ებმა შეიძლება კონკურენცია გაუწიონ გენეტიკურად შეცვლილ TCR-ებს პაციენტებში, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს კიბოს იმუნოთერაპიის პოტენციალზე. ამ პრობლემის გადასაჭრელად, CRISPR/Cas9-ის გამოყენებამ რეციპიენტ უჯრედებში ენდოგენური TCR-β-ს მოსაშორებლად და შემდგომში TCR-β T უჯრედების კიბოთი დაავადებულ პაციენტებში გადასაცემად, შეიძლება აჩვენოს უკეთესი კიბოს საწინააღმდეგო იმუნური პასუხები ენდოგენური TCR სექსუალური კონკურენციის საჭიროების გარეშე (Fan et al. 2018). ამრიგად, CRISPR-მოდიფიცირებული T უჯრედების გარდა, TCR-ები ათასჯერ უფრო მგრძნობიარეა სიმსივნური ანტიგენების მიმართ, ვიდრე ნორმალური TCR-ტრანსდუცირებული T უჯრედები. გარდა ამისა, სხვადასხვა ლეიკემიის დროს, γδ TCR+ CRISPR-ით გენერირებული შეცვლილი T უჯრედები ავლენენ CD4+ და CD8+ T უჯრედების უფრო მაღალ ექსპრესიას, ვიდრე სტანდარტული TCR გადატანა (Legut et al., 2018). ამგვარად, CRISPR/Cas9-ით გენერირებული მოდიფიცირებული T უჯრედები შეიძლება იყოს TNBC-ის დასაძლევად ეფექტური იმუნოთერაპიის მეთოდი.
ინტეგრინები წარმოადგენენ უჯრედული ადჰეზიის მოლეკულებს, რომლებიც იმყოფებიან უჯრედულ ტრანსმემბრანებში და ხელს უწყობენ უჯრედების შეკავშირებას უჯრედგარე მატრიქსთან (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). ინტეგრინების დისრეგულაცია დაკავშირებულია კიბოს განვითარებასა და მიგრაციასთან უჯრედგარე მატრიქსის შეცვლით, რაც იწვევს კიბოს უჯრედების გადარჩენას სისხლის მიმოქცევაში (Hamidi and Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-ით განპირობებული ინტეგრინის ნოკდაუნი ანელებს სიმსივნის პროგრესირებას, მეტასტაზირებას და კოლონიზაციას ტრანსპლანტაციულ კიბოში. ინტეგრინ a5-ის (ITGA5) ნოკდაუნი, როგორც აღინიშნა, ამცირებს უჯრედების მიგრაციას და პროგრესირებას სხვა კიბოს დროს, როგორიცაა ფილტვის კიბო (Ju et al., 2017), რაც მიუთითებს, რომ ინტეგრინ a5 ასევე შეიძლება იყოს ტრანსპლანტაციულ კიბოში პათოგენეზის მთავარი ფაქტორი.
ნოკაუტის თაგვების გენერირება ტრადიციული ემბრიონული ღეროვანი (ES) უჯრედების მეთოდების გამოყენებით შრომატევადი, დროის მომთხოვნი და არაეფექტური პროცესია. ES უჯრედების ჰომოლოგიური რეკომბინაციის გზით მიზანში ამოღებას, ქიმერული თაგვების გამრავლებას და შემდეგ მათ ჰეტეროზიგოტურ თაგვებთან შეჯვარებას ჰომოზიგოტური შთამომავლობის მისაღებად თვეები და წლები სჭირდება. მრავლობითი გენეტიკური მუტაციების მქონე თაგვების შესაქმნელად საჭიროა რთული შეჯვარება. თუმცა, მრავალი პრობლემა წარმოიშვა ES უჯრედების აბლაციით CRISPR/Cas9-ის გამოყენებით ან CRISPR/Cas9 კომპონენტების ერთუჯრედიან განაყოფიერებულ კვერცხუჯრედებში მიკროინექციის გზით გენერირებული თაგვების გამოყენებისას. მაგალითად, ცვლილებების შეტანა ხშირად ხდება ბიალეტურ ლოკუსებში და არ არის გენ-სპეციფიკური. ცოტა ხნის წინ გავრცელდა ინფორმაცია, რომ CRISPR/Cas9 ტექნოლოგიის გამოყენებით ES უჯრედებს შეუძლიათ ერთდროულად შეიტანონ ბიალელური მუტაციები 5-მდე გენში (Nishizono et al., 2021). ამ მიზნით, Cas9 mRNA და ხუთი გენ-სპეციფიკური gRNA ერთდროულად ტრანსფექტირებული იქნა ES უჯრედებში. ეს ხაზს უსვამს ამ პროცედურის პერსპექტივას და ეფექტურობას, თუმცა ეს მუტაციები შესაძლოა გადაცემულიყო, როდესაც ფუძემდებლური ხაზები ხუთმაგი ნოკაუტის თაგვების მისაღებად გამოირჩეოდა. კვლევა ასევე მოულოდნელ აღმოჩენას აქვეყნებს: გენმოდიფიცირებული თაგვების შესაქმნელად ES უჯრედები აღარ არის საჭირო. ამის ნაცვლად, კონკრეტული გენური პროდუქტების მოსაშორებლად, Cas9 mRNA და gRNA შეიყვანეს ერთუჯრედიან სტადიის ემბრიონებში. შედეგად, შეიქმნა ნოკაუტის ფუძემდებლური ხაზები, რომელთა თეორიულად გამოყენება შესაძლებელია თაგვებში გენის წაშლის შედეგების შესასწავლად (Qin et al., 2016). ამრიგად, CRISPR/Cas9 საშუალებას იძლევა შეიქმნას ტრანსგენური თაგვები ტრანსგენური თაგვების სამკურნალოდ ტრადიციულ გენეტიკურ ინჟინერიასთან შედარებით უფრო დაბალ ფასად. CRISPR/Cas სისტემის გამოყენებით, შემუშავდა ნოკაუტის თაგვის ახალი მოდელი, რომელსაც შეუძლია წარმატებით შეიტანოს წერტილოვანი მუტაციები TNBC-ში ერთ ან რამდენიმე ენდოგენურ გენში. ამ კონცეფციის საფუძველზე, TNBC-ის ცხოველური მოდელების შემუშავება ასევე შესაძლებელია BRCA1-ისა და p53-ის CRISPR/Cas9-ით განპირობებული დელეციის გამოყენებით, რაც იწვევს HR აღდგენის დაკარგვას, გენომის არასტაბილურობას და მუტანტურ ფენოტიპებს (Annunziato et al., 2020).
ამჟამად, ტრანსცეფციული კიბოს დიაგნოზირებისთვის გამოიყენება სხვადასხვა მეთოდი, როგორიცაა მამოგრაფია, მაგნიტურ-რეზონანსული ტომოგრაფია (MRI) და ულტრაბგერითი გამოკვლევა. თუმცა, ამ მეთოდებს გარკვეული შეზღუდვები აქვთ. მამოგრაფია გამოიყენება სარძევე ჯირკვლის ადგილობრივი ქსოვილის დიაგნოზირებისთვის და არა მეტასტაზების, სადაც კიბოს უჯრედები სხვა ორგანოებშია მიგრირებული. ულტრაბგერითი გამოკვლევა არ არის ტრანსცეფციული კიბოს დიაგნოზის საიმედო მეთოდი (Chen and Lee-Felker, 2023). მაგნიტურ-რეზონანსულ ტომოგრაფიას უფრო მაღალი მგრძნობელობა აქვს, ვიდრე ულტრაბგერით გამოკვლევას და მამოგრაფიას, მაგრამ მისი დიაგნოსტიკური სიზუსტე შეზღუდულია (Sha and Chen, 2022). ქსოვილის ბიოფსია კიბოს უჯრედების იდენტიფიცირების ინვაზიური მეთოდია. თუმცა, ზოგიერთ შემთხვევაში, ბიოფსიამ შეიძლება გამოტოვოს სიმსივნური ქსოვილი, თუ ნემსი ინტერესის არეალს მოშორდება. გარდა ამისა, ის ძალიან ძვირია და შეიძლება ტრავმული იყოს პაციენტისთვის. ტრანსცეფციული კიბოს ჰეტეროგენული ტიპია, ამიტომ ბიოფსიამ შეიძლება არ მოგვაწოდოს საკმარისი ინფორმაცია კიბოს ტიპის შესახებ. ამიტომ, სასწრაფოდ არის საჭირო ტრანსცეფციული კიბოს გამოსავლენად ახალი დიაგნოსტიკურად საიმედო მეთოდი. CRISPR/Cas9 შეიძლება იყოს მაღალმგრძნობიარე და მინიმალურად ინვაზიური ალტერნატივა სარძევე ჯირკვლის კიბოს დიაგნოზირებისთვის. ამ მიზნით, CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებული სტრატეგიების გამოყენება შესაძლებელია TNBC-ის დიაგნოზის PCR მეთოდების გასაუმჯობესებლად. პირველ რიგში, CRISPR სისტემის Cas9 და cpf1 ცილები გამოიყენება არასპეციფიკური დნმ-ის მოსაშორებლად, შემდეგ კი ეს ორი ცილა (Cas9 და cpf1) ამოიცნობს PAM თანმიმდევრობას სამიზნე დნმ-თან შეკავშირებამდე (Deepak Singh et al., 2021). ამრიგად, PCR-ს შეუძლია კიბოს განვითარებასთან დაკავშირებული მუტაციების იდენტიფიცირება. რამდენიმე კვლევამ გამოიყენა CRISPR-ზე დაფუძნებული ეს სტრატეგია სხვადასხვა კიბოში სხვადასხვა მუტაციების გამოსავლენად (Safari et al., 2019). ამრიგად, CRISPR-ზე დაფუძნებული PCR მეთოდებმა შეიძლება შეამციროს TNBC დიაგნოზის დამოკიდებულება ინვაზიურ მეთოდებზე, როგორიცაა ბიოფსიაზე დაფუძნებული იმუნოჰისტოქიმია.
ჰორმონის რეცეპტორების რეგულაციის გენოტიპური ცვლილებები ასევე დადასტურდა ტრანსცხიმული კიბოთი (TNBC) (Chen and Russo, 2009). CRISPR/Cas9-ზე დაფუძნებული PCR სტრატეგიები, რომლებიც იყენებენ მიკრომასივებს სამედიცინო დახმარების წერტილებში დიაგნოსტიკისთვის, ეფექტურად აკონტროლებს ამ მუტაციების ანალიზს (Hajian et al., 2019). მას ასევე შეუძლია ჯანდაცვის პროვაიდერებს მიაწოდოს შესაბამისი ინფორმაცია TNBC პაციენტებში სპეციფიკური მუტაციების შესახებ, რაც შეიძლება დაეხმაროს მათ მკურნალობის კურსის გაუმჯობესებაში. თუმცა, ამ კომბინირებულ ტექნიკას აქვს შეზღუდვები. ამიტომ, საჭიროა ფართომასშტაბიანი კვლევითი სამუშაოები, სანამ ეს CRISPR/Cas-PCR მეთოდი გამოყენებული იქნება ჯანდაცვაში TNBC-ის დიაგნოზირებისთვის (Yang et al., 2019).